| 查看: 3214 | 回复: 20 | |||||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||||||
[交流]
PCR相关问题解答
|
|||||||
|
近期，很多新虫友问到与PCR相关的问题，共同点只有一个：P不出来。这个过程很煎熬，从事分子生物学稍微久一点的虫子都知道，这都是说起来容易做起来难的工作。基于我多年的经验和教训，大致原因总结如下： 1. 最可能出现的问题是引物特异性。一般DNA/RNA/质粒提取，不会出现太大问题的话，引物特异性是决定PCR成败的首要因素。所以在设计引物的时候，一定要谨慎，严格按照引物设计的原则来进行，尤其是刚刚涉及本领域的虫友们，还是按照规矩来比较好。很多虫友可能是拿到别人设计的引物来做扩增，这个时候最好是拿到引物设计的最初资源，或者自己再用Primer去检测一下，确认之后再做扩增，这对你后面的分析会有很大帮助。 2. 反应体系的优化。反应体系对PCR扩增的决定也是至关重要的，选择合适的扩增酶和其对应的酶buffer是反应体系合理的首要因素。不同的实验目的对酶的选择有针对性，若只是检测，检测条带有无或大小，可用普通的扩增酶即可；若是需要测序，进行后续实验，i就要选取高保真酶；一些特殊的目的片段可能需要选取一些特殊的酶来进行扩增。各大扩增酶供应现在都比较齐全和成熟，大可与供应商联系交流，选择合适自己的酶。其他几个组分也需要注意，如Mg2+是否有加，dNTP是否有效，模板是否合适。反应体系的优化是个排除法，做得出来，你一般不会注意。但做不出来，就要一一排除。 3. 反应程序的选择。不同的扩增酶对应着不同的反应程序，看好protocal再进行程序设置。这里最需要注意的可能就是退火温度的选择，通常来说，退火温度使用你设计引物时的温度，如果不合适，可能就要做梯度，这个过程也比较繁琐。个人教训是先关注降低3-5度的结果，若还没结果，可能就要做上下10度的梯度PCR。 4. 凝胶的制备和电泳。很多虫友上传一张凝胶电泳图问原因，这个一般很难解答到底哪个地方出错了，最可能的就是上述三点的问题。但是凝胶的制备也会影响你最终成像的结果，凝胶的低浓度，EB的量，凝胶孔的大小，电压的大小都会影响到你最终图片的效果。 总之，PCR是个分子生物学的一个基本技术。粗略总结起来，就以上几点。还是那句话，顺利的时候，一次性就出来了；但只有不顺利，才会让你找原因，才会理解和进步。这是个人的教训总结，希望对大家有用。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生物知识 | 分子生物学 | 分子生物 | 科研相关 |
» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有55人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 荧光定量PCR内参问题
已经有3人回复
- 如何构建PCR反应体系、PCR反应条件
已经有11人回复
- 多重PCR与普通PCR反应的差别主要是什么
已经有9人回复
- 请教关于qRT-PCR对照设置的一些问题
已经有7人回复
- 新手做荧光定量PCR几个疑问求解答！！
已经有13人回复
- 请问qRT-PCR的标准曲线中扩增效率过高是怎么回事
已经有8人回复
- 菌液pcr总是做不出！求高手解答！
已经有18人回复
- 相对定量PCR对照组的bar问题，急求解答，在线等！
已经有14人回复
- 有关RT-PCR模板RNA量的问题，请高手解答！！！
已经有16人回复
- PCR出现非特异性扩增，求高手解答
已经有9人回复
- 关于qPCR的几个问题，求解答
已经有3人回复
- IQ5 RT-QPCR问题求助
已经有8人回复
- PCR标准体系有关问题。。求高手解答
已经有5人回复
- PCR引物的量如何确定，求助高手指教
已经有11人回复
- 荧光定量PCR-最全的疑难问题解答！！！
已经有294人回复
- 大片段PCR扩增求助
已经有34人回复
- RNA出现降解，还能做后面的荧光定量PCR吗？
已经有22人回复
- 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法
已经有15人回复
- 【资料】分子生物学常见问题解答
已经有30人回复
- 向RTPCR高手求助，关于RTPCR的空白对照问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】PCR后没有目的条带，有非特异性条带，求解决办法？？
已经有20人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
告别流水线爽文！108万字完结仙侠《女娲石之灵石奇缘（仙界篇）》值得细品
+1/5021
-
2026年工程管理与智慧城市国际会议 (EMSC 2026)
+1/558
-
真诚征友
+1/170
-
基金祈福
+1/153
-
散金币
+1/120
-
[IEEE出版|EI检索|推荐至SCI专刊]第22届国际电子商务工程会议征稿3天倒计时!
+1/89
-
从反复试错到智驱突破：固态电池研发的效率跃迁之路
+1/88
-
武汉，诚征男友，不异地，年龄大了
+1/34
-
论文祈福
+1/18
-
祈福基金得中，科研生涯顺利圆满
+1/14
-
中国地质大学（武汉）3D打印微纳光刻方向招收申请考核博士生
+2/12
-
量子物理团队招收博士生
+1/5
-
【即将截止】东北大学理学院 力学 李健组2027级保研
+1/5
-
中科院大连化学物理研究所 招聘 催化剂研发方向 科研助理 2名
+1/4
-
中山大学具身智能方向招2027届考核制博士生
+1/3
-
祈祷老公中国基
+1/3
-
中山大学智能传感仪器方向招2027届考核制博士生
+1/2
-
新审查指南施行半年，AI方向的专利申请是不是更看"技术味"了？
+1/2
-
南方医科大学深圳医院陈烨/余涛教授课题组联合培养博士后招聘
+1/2
-
出全新蔡司 Plan?APOCHROMAT 20×/0.8 平场复消色差物镜
+1/2
12楼2015-08-26 10:35:42
2楼2015-05-16 11:17:56
3楼2015-05-16 13:27:00
9楼2015-05-22 13:47:37
