| 查看: 2827 | 回复: 20 | |||||||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||||||
[交流]
PCR相关问题解答
|
|||||||
|
近期，很多新虫友问到与PCR相关的问题，共同点只有一个：P不出来。这个过程很煎熬，从事分子生物学稍微久一点的虫子都知道，这都是说起来容易做起来难的工作。基于我多年的经验和教训，大致原因总结如下： 1. 最可能出现的问题是引物特异性。一般DNA/RNA/质粒提取，不会出现太大问题的话，引物特异性是决定PCR成败的首要因素。所以在设计引物的时候，一定要谨慎，严格按照引物设计的原则来进行，尤其是刚刚涉及本领域的虫友们，还是按照规矩来比较好。很多虫友可能是拿到别人设计的引物来做扩增，这个时候最好是拿到引物设计的最初资源，或者自己再用Primer去检测一下，确认之后再做扩增，这对你后面的分析会有很大帮助。 2. 反应体系的优化。反应体系对PCR扩增的决定也是至关重要的，选择合适的扩增酶和其对应的酶buffer是反应体系合理的首要因素。不同的实验目的对酶的选择有针对性，若只是检测，检测条带有无或大小，可用普通的扩增酶即可；若是需要测序，进行后续实验，i就要选取高保真酶；一些特殊的目的片段可能需要选取一些特殊的酶来进行扩增。各大扩增酶供应现在都比较齐全和成熟，大可与供应商联系交流，选择合适自己的酶。其他几个组分也需要注意，如Mg2+是否有加，dNTP是否有效，模板是否合适。反应体系的优化是个排除法，做得出来，你一般不会注意。但做不出来，就要一一排除。 3. 反应程序的选择。不同的扩增酶对应着不同的反应程序，看好protocal再进行程序设置。这里最需要注意的可能就是退火温度的选择，通常来说，退火温度使用你设计引物时的温度，如果不合适，可能就要做梯度，这个过程也比较繁琐。个人教训是先关注降低3-5度的结果，若还没结果，可能就要做上下10度的梯度PCR。 4. 凝胶的制备和电泳。很多虫友上传一张凝胶电泳图问原因，这个一般很难解答到底哪个地方出错了，最可能的就是上述三点的问题。但是凝胶的制备也会影响你最终成像的结果，凝胶的低浓度，EB的量，凝胶孔的大小，电压的大小都会影响到你最终图片的效果。 总之，PCR是个分子生物学的一个基本技术。粗略总结起来，就以上几点。还是那句话，顺利的时候，一次性就出来了；但只有不顺利，才会让你找原因，才会理解和进步。这是个人的教训总结，希望对大家有用。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 分子生物知识 | 分子生物学 | 分子生物 | 科研相关 |
» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有222人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有16人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
-
湖北师范大学招调剂啦
已经有6人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 荧光定量PCR内参问题
已经有3人回复
- 如何构建PCR反应体系、PCR反应条件
已经有11人回复
- 多重PCR与普通PCR反应的差别主要是什么
已经有9人回复
- 请教关于qRT-PCR对照设置的一些问题
已经有7人回复
- 新手做荧光定量PCR几个疑问求解答！！
已经有13人回复
- 请问qRT-PCR的标准曲线中扩增效率过高是怎么回事
已经有8人回复
- 菌液pcr总是做不出！求高手解答！
已经有18人回复
- 相对定量PCR对照组的bar问题，急求解答，在线等！
已经有14人回复
- 有关RT-PCR模板RNA量的问题，请高手解答！！！
已经有16人回复
- PCR出现非特异性扩增，求高手解答
已经有9人回复
- 关于qPCR的几个问题，求解答
已经有3人回复
- IQ5 RT-QPCR问题求助
已经有8人回复
- PCR标准体系有关问题。。求高手解答
已经有5人回复
- PCR引物的量如何确定，求助高手指教
已经有11人回复
- 荧光定量PCR-最全的疑难问题解答！！！
已经有294人回复
- 大片段PCR扩增求助
已经有34人回复
- RNA出现降解，还能做后面的荧光定量PCR吗？
已经有22人回复
- 求助！大片段4kb左右基因PCR克隆方法
已经有15人回复
- 【资料】分子生物学常见问题解答
已经有30人回复
- 向RTPCR高手求助，关于RTPCR的空白对照问题
已经有9人回复
- 【求助/交流】PCR后没有目的条带，有非特异性条带，求解决办法？？
已经有20人回复
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
三峡大学材料与化工学院高分子化工新材料课题组现招收化学学术型硕士研究生2名。
+1/486
-
【招聘】温州医科大学/附属医院/瓯江实验室李校堃院士团队诚聘博士后和科研人员
+1/182
-
2026江西科技师范大学申亮组招硕士研究生
+1/86
-
中国石油大学（华东）化学化工学院学硕、专硕接收调剂
+1/41
-
2026中山大学孙逸仙纪念医院刘兆宇课题组招收调剂硕士研究生
+1/37
-
五邑大学环境与化学工程学院先进有机高分子材料团队
+1/36
-
新疆碳纳米材料制备与应用重点实验室2026年招聘启事
+1/34
-
哈尔滨工业大学深圳 金属增材制造方向博士招生
+1/33
-
浙江省人民医院博士后岗位招聘
+1/32
-
武汉纺织大学招收化学化工类和材料类研究生调剂生若干名
+1/15
-
烟台大学精准材料高等研究院26年材料方向研究生招生
+1/10
-
【博士招生】天津理工大学国家杰青王铁课题组招收2026年博士研究生
+1/9
-
上海工程技术大学李聪玲课题组招收调剂生
+1/9
-
福建师范大学环境微生物技术课题组接受2026级硕士调剂。计划招收2-3名。
+1/8
-
大连工业大学考研调剂
+1/5
-
苏州初创公司诚聘有机合成化学家
+1/4
-
武汉工程大学化学与环境工程学院招收调剂生
+1/4
-
招调剂生
+1/3
-
哈工大韩飞课题组招收3D微纳加工、光学工程、纳米化学等方向博士生及博后（长期有效）
+1/1
-
湖北师范大学材料科学与工程学院 2026年硕士研究生招生调剂公告
+1/1
12楼2015-08-26 10:35:42
2楼2015-05-16 11:17:56
3楼2015-05-16 13:27:00
9楼2015-05-22 13:47:37
