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1576127095新虫 (初入文坛)
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[求助]
基因敲除中的一次同源重组问题 已有1人参与
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一次同源重组总是重组不上，请大侠赐教一下一次同源重组的注意事项，做不出来很着急 |
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新虫 (初入文坛)
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3楼2015-05-14 14:32:37
RuyangHan
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2楼2015-05-14 10:52:42
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【答案】应助回帖
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我猜你就是这个问题，你是用重组质粒转化，然后用PCR筛选吗？ 我是10个中9个假阳性，1个二次重组突变。你也可能都是假阳性，这是没办法控制的。也有可能没有检测出来，PCR检出的假阳性的条带要是很弱，就应该注意是不是背景污染，其实是真的阳性。 假如你不愿意多筛，还可以试试下面两种方法： 1. 把你的重组质粒切开成链状，这样直链DNA片段转化到菌体中，单交换是致死的，没有菌落，获得的菌落都是阳性。问题是大的质粒切开后很长，使转化效率很低。 2. 把质粒中的左右两边同源和抗性基因这一段用PCR扩增出来，大概3-4K，不太长了，用这个片段来做转化，得到的菌落也是只有突变阳性的。 |
4楼2015-05-15 08:28:54
