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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 基因敲除双交换问题
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baidiliulian

木虫 (小有名气)

[求助] 基因敲除双交换问题 已有4人参与

我是通过接合转移无痕敲除基因，双交换的是总是筛出来的是野生型，大家有没有好的方法筛到突变株。
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1楼 2014-07-21 10:40:29
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
baidiliulian(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-31 09:04:09
引用回帖:
5楼: Originally posted by baidiliulian at 2014-07-22 11:23:04
影响同源重组的特殊序列有什么特征？...

这个就因菌而异了，有的序列容易同源重组，或者形成特殊结构，或者结合一些蛋白，或者有特殊修饰，影响都不同。有成熟的方法，这是最后才考虑到。
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6楼2014-07-22 12:04:51
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-21 16:52:26
全是野生菌还是重组效率不高与筛选效率低的问题
1.现在有种单交换的无缝敲除，重组几率肯定比双交换高。
2.既然你是无缝克隆，那你后期是怎么筛选的？缺陷型吗？
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大家相互帮助哈
2楼2014-07-21 11:36:09
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-21 16:52:35
baidiliulian: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-07-22 11:23:44
1、敲除的基因不能是致死的，不能严重影响生长，有一定的影响的话，可以挑选小个的克隆子或者在利于敲除株生长的筛选平板上筛选。
2、上下游同源臂长度一致，且不存在影响同源重组的特殊序列。
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3楼2014-07-21 11:58:04
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baidiliulian

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 11:36:09
全是野生菌还是重组效率不高与筛选效率低的问题
1.现在有种单交换的无缝敲除，重组几率肯定比双交换高。
2.既然你是无缝克隆，那你后期是怎么筛选的？缺陷型吗？

利用PCR验证啊，P出来的条带短的菌就是缺陷型啊
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4楼2014-07-22 11:21:55
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baidiliulian

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-07-21 11:58:04
1、敲除的基因不能是致死的，不能严重影响生长，有一定的影响的话，可以挑选小个的克隆子或者在利于敲除株生长的筛选平板上筛选。
2、上下游同源臂长度一致，且不存在影响同源重组的特殊序列。

影响同源重组的特殊序列有什么特征？
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5楼2014-07-22 11:23:04
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leizhang315

新虫 (小有名气)
你好，请问你做过p1转导实验室吗？想请教一下！谢谢！
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7楼2014-07-28 08:11:32
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baidiliulian

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by leizhang315 at 2014-07-28 08:11:32
你好，请问你做过p1转导实验室吗？想请教一下！谢谢！

没做过
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8楼2014-07-30 10:05:51
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flhua

木虫 (正式写手)

bachelordom

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 11:36:09
全是野生菌还是重组效率不高与筛选效率低的问题
1.现在有种单交换的无缝敲除，重组几率肯定比双交换高。
2.既然你是无缝克隆，那你后期是怎么筛选的？缺陷型吗？

我已经鉴定是单臂交换了，希望通过另外一个臂交换得到突变株，即双交换（目的突变株）。可是好像单臂交换后，再次进行筛选又从相同臂交换，变回野生型，很是郁闷，筛了2000个克隆，50个第二次交换株，但都是野生型。
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只要有梦想，坚持就一定能实现
9楼2014-07-30 17:34:44
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flhua

木虫 (正式写手)

bachelordom
引用回帖:
4楼: Originally posted by baidiliulian at 2014-07-22 11:21:55
利用PCR验证啊，P出来的条带短的菌就是缺陷型啊...

每次P出来都是野生型长带，2000个筛选到50多个敏感菌株，但都恢复成野生型了。
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只要有梦想，坚持就一定能实现
10楼2014-07-30 17:35:53
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