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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 基因敲除双交换问题
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baidiliulian

木虫 (小有名气)

[求助] 基因敲除双交换问题已有4人参与

我是通过接合转移无痕敲除基因，双交换的是总是筛出来的是野生型，大家有没有好的方法筛到突变株。
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1楼2014-07-21 10:40:29
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flhua

木虫 (正式写手)

bachelordom

【答案】应助回帖

引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 11:36:09
全是野生菌还是重组效率不高与筛选效率低的问题
1.现在有种单交换的无缝敲除，重组几率肯定比双交换高。
2.既然你是无缝克隆，那你后期是怎么筛选的？缺陷型吗？

我已经鉴定是单臂交换了，希望通过另外一个臂交换得到突变株，即双交换（目的突变株）。可是好像单臂交换后，再次进行筛选又从相同臂交换，变回野生型，很是郁闷，筛了2000个克隆，50个第二次交换株，但都是野生型。
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只要有梦想，坚持就一定能实现
9楼2014-07-30 17:34:44
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flhua

木虫 (正式写手)

bachelordom
引用回帖:
4楼: Originally posted by baidiliulian at 2014-07-22 11:21:55
利用PCR验证啊，P出来的条带短的菌就是缺陷型啊...

每次P出来都是野生型长带，2000个筛选到50多个敏感菌株，但都恢复成野生型了。
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只要有梦想，坚持就一定能实现
10楼2014-07-30 17:35:53
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flhua

木虫 (正式写手)

bachelordom

【答案】应助回帖

★ ★
baidiliulian(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-31 09:05:00
引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 11:36:09
全是野生菌还是重组效率不高与筛选效率低的问题
1.现在有种单交换的无缝敲除，重组几率肯定比双交换高。
2.既然你是无缝克隆，那你后期是怎么筛选的？缺陷型吗？

1，重组概率不是很低，能筛选到单臂交换菌株，就是说可以发生重组；但是每次从哪个臂交换上，从哪个臂又交换下来；
2，单纯敲除掉某个基因，考察该基因功能，不是营养缺陷性突变株构建。
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只要有梦想，坚持就一定能实现
11楼2014-07-30 17:40:34
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