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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 基因敲除双交换问题
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flhua

木虫 (正式写手)

bachelordom

【答案】应助回帖

★ ★
baidiliulian(西门吹雪170代发): 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-07-31 09:05:00
引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 11:36:09
全是野生菌还是重组效率不高与筛选效率低的问题
1.现在有种单交换的无缝敲除，重组几率肯定比双交换高。
2.既然你是无缝克隆，那你后期是怎么筛选的？缺陷型吗？

1，重组概率不是很低，能筛选到单臂交换菌株，就是说可以发生重组；但是每次从哪个臂交换上，从哪个臂又交换下来；
2，单纯敲除掉某个基因，考察该基因功能，不是营养缺陷性突变株构建。
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只要有梦想，坚持就一定能实现
11楼2014-07-30 17:40:34
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金书豆豆

木虫 (小有名气)
用什么载体敲除？
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12楼2014-07-30 23:58:13
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by flhua at 2014-07-30 17:34:44
我已经鉴定是单臂交换了，希望通过另外一个臂交换得到突变株，即双交换（目的突变株）。可是好像单臂交换后，再次进行筛选又从相同臂交换，变回野生型，很是郁闷，筛了2000个克隆，50个第二次交换株，但都是野生型 ...

不知道你用的什么筛选标记？觉得你的双交换效率偏低，2000个才有50个；在没有压力的条件下，于液体培养基中转接培养两次，可能会提高双交换的比例。
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13楼2014-07-31 09:19:33
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christine121

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by zhaodahe at 2014-07-31 09:19:33
不知道你用的什么筛选标记？觉得你的双交换效率偏低，2000个才有50个；在没有压力的条件下，于液体培养基中转接培养两次，可能会提高双交换的比例。...

请问 在液体培养基中发生二次交换时，要加萘啶酮酸吗，在蔗糖筛选培养基中加萘啶酮酸吗，请问萘啶酮酸的作用是什么
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14楼2015-03-09 16:15:00
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爱总是年轻

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by flhua at 2014-07-30 17:34:44
我已经鉴定是单臂交换了，希望通过另外一个臂交换得到突变株，即双交换（目的突变株）。可是好像单臂交换后，再次进行筛选又从相同臂交换，变回野生型，很是郁闷，筛了2000个克隆，50个第二次交换株，但都是野生型 ...

请问楼主是如何确定已经发生单交换的。我有一个问题想请教，发生了接合转移之后，在抗性平板上涂布能够生长的菌落是否可以初步认为质粒已经转入受体菌，还是可能已经发生了单交换，是否存在一种可能性是，质粒转入后并没有整合到基因组中？
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总有人要赢，为什么那个不能是我
15楼2017-11-27 21:52:47
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爱总是年轻

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by flhua at 2014-07-30 17:35:53
每次P出来都是野生型长带，2000个筛选到50多个敏感菌株，但都恢复成野生型了。...

楼主的意思是，筛选到双交换之后再进行传代又恢复成野生型了？目前进展如何了？我还卡在接合转移的地方，能不能给个联系方式。
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总有人要赢，为什么那个不能是我
16楼2017-12-13 21:22:19
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