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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 基因敲除双交换问题
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baidiliulian

木虫 (小有名气)

[求助] 基因敲除双交换问题 已有4人参与

我是通过接合转移无痕敲除基因，双交换的是总是筛出来的是野生型，大家有没有好的方法筛到突变株。
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1楼 2014-07-21 10:40:29
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爱总是年轻

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by flhua at 2014-07-30 17:35:53
每次P出来都是野生型长带，2000个筛选到50多个敏感菌株，但都恢复成野生型了。...

楼主的意思是，筛选到双交换之后再进行传代又恢复成野生型了？目前进展如何了？我还卡在接合转移的地方，能不能给个联系方式。
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总有人要赢，为什么那个不能是我
16楼2017-12-13 21:22:19
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-21 16:52:26
全是野生菌还是重组效率不高与筛选效率低的问题
1.现在有种单交换的无缝敲除，重组几率肯定比双交换高。
2.既然你是无缝克隆，那你后期是怎么筛选的？缺陷型吗？
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大家相互帮助哈
2楼2014-07-21 11:36:09
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-21 16:52:35
baidiliulian: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-07-22 11:23:44
1、敲除的基因不能是致死的，不能严重影响生长，有一定的影响的话，可以挑选小个的克隆子或者在利于敲除株生长的筛选平板上筛选。
2、上下游同源臂长度一致，且不存在影响同源重组的特殊序列。
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3楼2014-07-21 11:58:04
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baidiliulian

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 11:36:09
全是野生菌还是重组效率不高与筛选效率低的问题
1.现在有种单交换的无缝敲除，重组几率肯定比双交换高。
2.既然你是无缝克隆，那你后期是怎么筛选的？缺陷型吗？

利用PCR验证啊，P出来的条带短的菌就是缺陷型啊
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4楼2014-07-22 11:21:55
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