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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 基因敲除双交换问题
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baidiliulian

木虫 (小有名气)

[求助] 基因敲除双交换问题 已有4人参与

我是通过接合转移无痕敲除基因，双交换的是总是筛出来的是野生型，大家有没有好的方法筛到突变株。
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1楼 2014-07-21 10:40:29
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爱总是年轻

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by flhua at 2014-07-30 17:34:44
我已经鉴定是单臂交换了，希望通过另外一个臂交换得到突变株，即双交换（目的突变株）。可是好像单臂交换后，再次进行筛选又从相同臂交换，变回野生型，很是郁闷，筛了2000个克隆，50个第二次交换株，但都是野生型 ...

请问楼主是如何确定已经发生单交换的。我有一个问题想请教，发生了接合转移之后，在抗性平板上涂布能够生长的菌落是否可以初步认为质粒已经转入受体菌，还是可能已经发生了单交换，是否存在一种可能性是，质粒转入后并没有整合到基因组中？
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总有人要赢，为什么那个不能是我
15楼2017-11-27 21:52:47
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-07-21 16:52:26
全是野生菌还是重组效率不高与筛选效率低的问题
1.现在有种单交换的无缝敲除，重组几率肯定比双交换高。
2.既然你是无缝克隆，那你后期是怎么筛选的？缺陷型吗？
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大家相互帮助哈
2楼2014-07-21 11:36:09
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-07-21 16:52:35
baidiliulian: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-07-22 11:23:44
1、敲除的基因不能是致死的，不能严重影响生长，有一定的影响的话，可以挑选小个的克隆子或者在利于敲除株生长的筛选平板上筛选。
2、上下游同源臂长度一致，且不存在影响同源重组的特殊序列。
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3楼2014-07-21 11:58:04
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baidiliulian

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-07-21 11:36:09
全是野生菌还是重组效率不高与筛选效率低的问题
1.现在有种单交换的无缝敲除，重组几率肯定比双交换高。
2.既然你是无缝克隆，那你后期是怎么筛选的？缺陷型吗？

利用PCR验证啊，P出来的条带短的菌就是缺陷型啊
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4楼2014-07-22 11:21:55
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