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毛毛虫989

铁虫 (初入文坛)

[求助] 镍柱纯化蛋白时,流出液及洗脱液如何处理已有2人参与

是这样的,我的目的蛋白是毕赤酵母表达的蛋白,蛋白主要在上清中,分子量在25kD左右,上清中蛋白的浓度为30mg/ml左右,我直接取12ml上清上柱,但是使用SDSPAGE检测时,不知如何处理每一个咪唑浓度收集的蛋白。
问题:1、要浓缩每一个咪唑浓度收集的蛋白吗?
          2、还有什么好的办法来处理收集的洗脱液呢?
现急需,谢谢!
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nemo88

禁虫 (小有名气)

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感谢参与,应助指数 +1
毛毛虫989: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-04-28 09:11:38
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2楼2015-04-27 16:17:08
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wlt728

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
在未确定那个浓度可以洗脱目的蛋白前,每一个浓度的样品都需要跑电泳!
I am not a hero , but I served with heroes!
3楼2015-04-27 22:12:47
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毛毛虫989

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wlt728 at 2015-04-27 22:12:47
在未确定那个浓度可以洗脱目的蛋白前,每一个浓度的样品都需要跑电泳!

那每个浓度洗脱下来的液体,比如说10个柱体积的,要浓缩后跑电泳吗?还是有其他的办法?

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4楼2015-04-27 22:43:40
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毛毛虫989

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by nemo88 at 2015-04-27 16:17:08
额  没有紫外检测?
如果直接洗脱的应该每份洗脱液都检测,浓缩应该不必,镍柱本来就属于富集型的柱子
过柱前样品,流穿液,洗脱液都应该检测的,

麻烦问一下,如果检测的话,上SDSPAGE前洗脱的或流出的液体该如何处理呢,我是用TCA,但是梯度洗脱的话操作起来比较麻烦

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5楼2015-04-27 22:52:51
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nemo88

禁虫 (小有名气)

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6楼2015-04-27 23:23:04
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毛毛虫989

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by nemo88 at 2015-04-27 23:23:04
TCA是哪种呢?沉淀富集蛋白吗?太酸肯定不适合过镍柱了,如果是富集的话,过镍柱不用富集处理的,直接过就行
处理的话,直接取样,加loading buffer煮就可以,你是怕检测不到吗?不行就做银染,有条件做western, ...

谢谢你的回答,我想再问一下你,我洗脱10个柱体积,收集的前三管,每一管是1ml的话,如何处理,我的实验室有2×的loading buffer,能说一下具体的细节吗?

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7楼2015-04-27 23:41:14
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nemo88

禁虫 (小有名气)

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8楼2015-04-28 13:41:05
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毛毛虫989

铁虫 (初入文坛)

送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by nemo88 at 2015-04-28 13:41:05
你用的什么柱子?试剂盒的还是1ml?5ml的呢?假如每管1ml的话,也就是说你只收了3ml?过亲和柱子一般还是要用柱体积来衡量。。
不过一般不用管每管多少体积,就是取20ul样品+20ul loading buffer,95~100℃5~10mi ...

谢谢

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9楼2015-04-28 18:33:10
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