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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 求助，镍柱纯化蛋白，蛋白挂不上去
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wzp9012

铁虫 (著名写手)

[求助] 求助，镍柱纯化蛋白，蛋白挂不上去 已有8人参与

小弟最近在做酶的纯化，用的康为世纪的镍柱，结果蛋白吸附不上去，结果流经液里蛋白浓度高，而且酶活挺高，洗脱液里反而很少。平衡液咪挫浓度为10mmol/l，洗脱液咪挫浓度为500mmol/l。后来听朋友说平衡液咪挫浓度再低点，结合的力强点，咪挫调整到5mmol/l，貌似还是上述情况。望有经验的师兄师姐多指点指点
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1楼 2013-12-19 10:20:42
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

kunge1983

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-12-20 15:25:41
咪唑浓度这么低还上不去 建议重新设计载体 或者变复性吧 估计是组氨酸标签在蛋白内部了
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3楼2013-12-20 05:48:29
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议你用无咪唑的buffer上样，有时标签结合力很弱
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6楼2013-12-20 13:02:50
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崔士元

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
会不会是His标签没有表达？你P片段时，TAA没有去掉？
赞一下(1人) 回复此楼
男人，就要对自己狠一点！
7楼2013-12-20 13:25:16
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普通回帖

lpzl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以多设置几个洗脱浓度。
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Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
2楼2013-12-19 13:14:41
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Allen206

银虫 (小有名气)
是原核表达的么？变形记处理一下看能不能挂柱？能的话就是空间结构的问题，换标签位置
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不想说什么，，，，
4楼2013-12-20 09:40:07
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b6122

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
冲洗用1mM的咪唑试试，用你平时的buffer量加倍冲洗

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2013-12-20 11:24:52
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wzp9012

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by chlorella409 at 2013-12-20 13:02:50
建议你用无咪唑的buffer上样，有时标签结合力很弱

恩，准备用无咪挫的的buffer上样试试，但请问洗去杂蛋白时用什么，之前含10mmol/l的咪挫的平衡液吗
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8楼2013-12-20 19:59:19
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wzp9012

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Allen206 at 2013-12-20 09:40:07
是原核表达的么？变形记处理一下看能不能挂柱？能的话就是空间结构的问题，换标签位置

是的，大肠杆菌表达系统，如果是空间结构变化了那还得重新开始了
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9楼2013-12-20 20:03:15
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wzp9012

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 崔士元 at 2013-12-20 13:25:16
会不会是His标签没有表达？你P片段时，TAA没有去掉？

这个还真不清楚，暑假过来时，老师给了12个种突变种，我就诱导表达纯化的，要怎样检查his标签有没有表达，要Western Blot吗？
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10楼2013-12-20 20:08:27
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