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wzp9012

铁虫 (著名写手)

[求助] 求助,镍柱纯化蛋白,蛋白挂不上去已有8人参与

小弟最近在做酶的纯化,用的康为世纪的镍柱,结果蛋白吸附不上去,结果流经液里蛋白浓度高,而且酶活挺高,洗脱液里反而很少。平衡液咪挫浓度为10mmol/l,洗脱液咪挫浓度为500mmol/l。后来听朋友说平衡液咪挫浓度再低点,结合的力强点,咪挫调整到5mmol/l,貌似还是上述情况。望有经验的师兄师姐多指点指点
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kunge1983

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-12-20 15:25:41
咪唑浓度这么低还上不去 建议重新设计载体 或者变复性吧 估计是组氨酸标签在蛋白内部了
3楼2013-12-20 05:48:29
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议你用无咪唑的buffer上样,有时标签结合力很弱
6楼2013-12-20 13:02:50
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崔士元

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
会不会是His标签没有表达?你P片段时,TAA没有去掉?
男人,就要对自己狠一点!
7楼2013-12-20 13:25:16
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普通回帖

lpzl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
可以多设置几个洗脱浓度。
Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
2楼2013-12-19 13:14:41
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Allen206

银虫 (小有名气)

是原核表达的么?变形记处理一下看能不能挂柱?能的话就是空间结构的问题,换标签位置
不想说什么,,,,
4楼2013-12-20 09:40:07
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b6122

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
冲洗用1mM的咪唑试试,用你平时的buffer量加倍冲洗

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2013-12-20 11:24:52
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wzp9012

铁虫 (著名写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by chlorella409 at 2013-12-20 13:02:50
建议你用无咪唑的buffer上样,有时标签结合力很弱

恩,准备用无咪挫的的buffer上样试试,但请问洗去杂蛋白时用什么,之前含10mmol/l的咪挫的平衡液吗
8楼2013-12-20 19:59:19
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wzp9012

铁虫 (著名写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Allen206 at 2013-12-20 09:40:07
是原核表达的么?变形记处理一下看能不能挂柱?能的话就是空间结构的问题,换标签位置

是的,大肠杆菌表达系统,如果是空间结构变化了那还得重新开始了
9楼2013-12-20 20:03:15
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wzp9012

铁虫 (著名写手)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 崔士元 at 2013-12-20 13:25:16
会不会是His标签没有表达?你P片段时,TAA没有去掉?

这个还真不清楚,暑假过来时,老师给了12个种突变种,我就诱导表达纯化的,要怎样检查his标签有没有表达,要Western Blot吗?
10楼2013-12-20 20:08:27
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