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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 镍柱纯化蛋白时，流出液及洗脱液如何处理
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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毛毛虫989

铁虫 (初入文坛)

[求助] 镍柱纯化蛋白时，流出液及洗脱液如何处理 已有2人参与

是这样的，我的目的蛋白是毕赤酵母表达的蛋白，蛋白主要在上清中，分子量在25kD左右，上清中蛋白的浓度为30mg/ml左右，我直接取12ml上清上柱，但是使用SDSPAGE检测时，不知如何处理每一个咪唑浓度收集的蛋白。
问题：1、要浓缩每一个咪唑浓度收集的蛋白吗？
          2、还有什么好的办法来处理收集的洗脱液呢？
现急需，谢谢！
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1楼 2015-04-27 11:57:04
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nemo88

禁虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
毛毛虫989: 金币+10, ★★★很有帮助 2015-04-28 09:11:38
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2楼2015-04-27 16:17:08
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wlt728

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
在未确定那个浓度可以洗脱目的蛋白前，每一个浓度的样品都需要跑电泳！
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I am not a hero , but I served with heroes！
3楼2015-04-27 22:12:47
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毛毛虫989

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wlt728 at 2015-04-27 22:12:47
在未确定那个浓度可以洗脱目的蛋白前，每一个浓度的样品都需要跑电泳！

那每个浓度洗脱下来的液体，比如说10个柱体积的，要浓缩后跑电泳吗？还是有其他的办法？

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4楼2015-04-27 22:43:40
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毛毛虫989

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by nemo88 at 2015-04-27 16:17:08
额  没有紫外检测？
如果直接洗脱的应该每份洗脱液都检测，浓缩应该不必，镍柱本来就属于富集型的柱子
过柱前样品，流穿液，洗脱液都应该检测的，

麻烦问一下，如果检测的话，上SDSPAGE前洗脱的或流出的液体该如何处理呢，我是用TCA，但是梯度洗脱的话操作起来比较麻烦

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5楼2015-04-27 22:52:51
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nemo88

禁虫 (小有名气)
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6楼2015-04-27 23:23:04
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毛毛虫989

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by nemo88 at 2015-04-27 23:23:04
TCA是哪种呢？沉淀富集蛋白吗？太酸肯定不适合过镍柱了，如果是富集的话，过镍柱不用富集处理的，直接过就行
处理的话，直接取样，加loading buffer煮就可以，你是怕检测不到吗？不行就做银染，有条件做western， ...

谢谢你的回答，我想再问一下你，我洗脱10个柱体积，收集的前三管，每一管是1ml的话，如何处理，我的实验室有2×的loading buffer，能说一下具体的细节吗？

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7楼2015-04-27 23:41:14
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nemo88

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毛毛虫989
8楼2015-04-28 13:41:05
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毛毛虫989

铁虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
8楼: Originally posted by nemo88 at 2015-04-28 13:41:05
你用的什么柱子？试剂盒的还是1ml？5ml的呢？假如每管1ml的话，也就是说你只收了3ml？过亲和柱子一般还是要用柱体积来衡量。。
不过一般不用管每管多少体积，就是取20ul样品+20ul loading buffer，95~100℃5~10mi ...

谢谢

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9楼2015-04-28 18:33:10
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