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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 质粒PCR定点突变之后跑完的电泳图几乎看不到条带，能帮我分析下可能原因么？
汕头大学海洋科学接受调剂
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1392919714

铜虫 (小有名气)

[求助] 质粒PCR定点突变之后跑完的电泳图几乎看不到条带，能帮我分析下可能原因么？ 已有4人参与

质粒PCR定点突变之后跑完的电泳图几乎看不到条带，能帮我分析下可能原因么？还有，Marker跑的也不太分散的原因？新手上路，请多支持
质粒PCR定点突变之后跑完的电泳图几乎看不到条带，能帮我分析下可能原因么？
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边走边看
1楼 2015-04-11 09:59:43
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wshi85

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
1392919714: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-04-12 15:19:09
很有可能你实验失败了！你用Dpn I 直接处理，做下转化验证是否实验成功
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很久没在虫虫上漂游了，觉得回归虫虫！
2楼2015-04-11 23:27:44
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seraphlx

新虫 (初入文坛)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2015-04-12 22:16:11
我最近也出现这种情况，我也是新手，不知道你解决了没，我是各种验证都不行，就是扩不出东西

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2015-04-11 23:28:32
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1392919714

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wshi85 at 2015-04-11 23:27:44
很有可能你实验失败了！你用Dpn I 直接处理，做下转化验证是否实验成功

终于遇到行家了，灰常感谢！
本来想做转化的，但被师姐说没有条带就说明失败了。第一次做好伤感。可能是质粒纯度不好，我用的OD260/280>1.9,打算下周重提质粒.
还有，我想问问设计的引物GC=64%，会不会是主要问题？
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边走边看
4楼2015-04-12 15:17:41
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1392919714

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by seraphlx at 2015-04-11 23:28:32
我最近也出现这种情况，我也是新手，不知道你解决了没，我是各种验证都不行，就是扩不出东西

木有啊。我就看过师姐做过一次就独立做了
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边走边看
5楼2015-04-12 15:18:41
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yuhan131481

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们突变PCR后  是不做电泳的  直接Dpn1消化后转化  挑取单克隆  送测序
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6楼2015-04-13 11:31:23
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安群星

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可能是PCR退火温度不合适，建议做温度梯度。同时，还可以在PCR体系中添加助剂如DMSO来提高扩增效率。一般情况下，只有要一点点的扩增产物（条带不亮没关系），用DpnI消化后直接转化，都能挑出阳性克隆。
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7楼2016-11-28 15:38:13
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