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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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王忆楠yn

新虫 (小有名气)

[求助] pcr反应cytb序列扩不出原因?求分析! 已有2人参与

本人本科生,目前做书虱的种内鉴定。之前用引物扩增ITS序列,电泳出现条带,但是送去公司检测,说亮带里有比较乱,无法测序。现在用引物扩增cytb序列,发现没有条带。
    试剂
ddh2o                                   31.5ul
dNTP                                         4ul
buffer(Mg2+)                             5ul
引物1                                       1.5ul                              4个ep管分装     每个ep12.5ul
引物2                                       1.5ul
taq酶                                       0.5ul
模板                                        6ul
(之前老师也做过几次,同样没有条带)退火温度为40.0   41.2  43.9   47.7   52.6   56.5  58.8    60.0“℃。
模板有一年了,但是its 有条带,很亮,只是无法测序。用新的模板可以扩出很亮的条带(cytb)。想求助是不是模板的问题.  
cytb:
F    TATGTACTACCATGAGGACAAATAT
R    ATTACACCTCCTAATTATTAGGAAT
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lomis

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-04-10 09:21:29
出现PCR有杂带确实无法测序,因为会有杂峰。模板不一定是主要问题,可能是你扩增出了非特异性条带,但是没有切胶纯化。
没有命运,只有选择!
2楼2015-04-10 09:04:46
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王忆楠yn

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lomis at 2015-04-10 09:04:46
出现PCR有杂带确实无法测序,因为会有杂峰。模板不一定是主要问题,可能是你扩增出了非特异性条带,但是没有切胶纯化。

谢谢!我试过新鲜的模板,cytb扩的条带特别好,而且测序也很成功 !但是旧的模板有时候会出现非常微弱的条带,大多没有条带。前几天做了个二次pcr发现出现条带,但是分子量好像小了一点。不知道是什么因素?

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2015-04-10 09:20:23
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lomis

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 王忆楠yn at 2015-04-10 09:20:23
谢谢!我试过新鲜的模板,cytb扩的条带特别好,而且测序也很成功 !但是旧的模板有时候会出现非常微弱的条带,大多没有条带。前几天做了个二次pcr发现出现条带,但是分子量好像小了一点。不知道是什么因素?
...

非特异性条带,PCR中经常会出现类似问题,可通过延长引物长度来解决。
没有命运,只有选择!
4楼2015-04-10 09:22:43
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王忆楠yn

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lomis at 2015-04-10 09:22:43
非特异性条带,PCR中经常会出现类似问题,可通过延长引物长度来解决。...

那我要换引物?or重新设置引物?这个引物是从文献上找的,别人能扩出来,我应该也扩的出来。

[ 发自小木虫客户端 ]
5楼2015-04-10 10:13:13
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lomis

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 王忆楠yn at 2015-04-10 10:13:13
那我要换引物?or重新设置引物?这个引物是从文献上找的,别人能扩出来,我应该也扩的出来。
...

尽信书不如无书,你既然没有做出来就应该想想问题怎么解决。
没有命运,只有选择!
6楼2015-04-10 16:10:53
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sh_9153

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-04-11 22:09:26
条带暗有可能是你引物问题,错配率高,由于你用其它模板可以扩出目的条带,证明引物自身没有问题,只有可能是引物和模板结合问题,或者是模板本身问题
1.尝试再一次降低退火温度,看是否能扩出来
2.重新设计引物,或者增加引物长度,提高引物特异性
3.认真检测一下模板,确定模板没有问题

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

7楼2015-04-10 16:26:40
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王忆楠yn

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by lomis at 2015-04-10 16:10:53
尽信书不如无书,你既然没有做出来就应该想想问题怎么解决。...

谨记
8楼2015-04-10 22:11:18
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王忆楠yn

新虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by sh_9153 at 2015-04-10 16:26:40
条带暗有可能是你引物问题,错配率高,由于你用其它模板可以扩出目的条带,证明引物自身没有问题,只有可能是引物和模板结合问题,或者是模板本身问题
1.尝试再一次降低退火温度,看是否能扩出来
2.重新设计引物, ...

我在等2次pcr测序结果,如果测的出,说明模板还是可以用的。我改变过很多次退火温度,但是找不到一个合适的退火温度,因为在上述哪个温度都出现过条带,而且都比较好。至于改变引物的话,比较麻烦,而且我是本科生,很快就面临实习,所以,这个方法我觉得对我可行性不太高。
9楼2015-04-10 22:21:00
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