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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » pcr反应cytb序列扩不出原因？求分析！
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王忆楠yn

新虫 (小有名气)

[求助] pcr反应cytb序列扩不出原因？求分析！ 已有2人参与

本人本科生，目前做书虱的种内鉴定。之前用引物扩增ITS序列，电泳出现条带，但是送去公司检测，说亮带里有比较乱，无法测序。现在用引物扩增cytb序列，发现没有条带。
    试剂
ddh2o                                   31.5ul
dNTP                                         4ul
buffer(Mg2+)                             5ul
引物1                                       1.5ul                              4个ep管分装     每个ep12.5ul
引物2                                       1.5ul
taq酶                                       0.5ul
模板                                        6ul
（之前老师也做过几次，同样没有条带）退火温度为40.0   41.2  43.9   47.7   52.6   56.5  58.8    60.0“℃。
模板有一年了，但是its 有条带，很亮，只是无法测序。用新的模板可以扩出很亮的条带（cytb）。想求助是不是模板的问题.  
cytb:
F    TATGTACTACCATGAGGACAAATAT
R    ATTACACCTCCTAATTATTAGGAAT
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1楼 2015-04-09 22:55:08
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lomis

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2015-04-10 09:21:29
出现PCR有杂带确实无法测序，因为会有杂峰。模板不一定是主要问题，可能是你扩增出了非特异性条带，但是没有切胶纯化。
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没有命运，只有选择！
2楼2015-04-10 09:04:46
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王忆楠yn

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lomis at 2015-04-10 09:04:46
出现PCR有杂带确实无法测序，因为会有杂峰。模板不一定是主要问题，可能是你扩增出了非特异性条带，但是没有切胶纯化。

谢谢！我试过新鲜的模板，cytb扩的条带特别好，而且测序也很成功 ！但是旧的模板有时候会出现非常微弱的条带，大多没有条带。前几天做了个二次pcr发现出现条带，但是分子量好像小了一点。不知道是什么因素？

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3楼2015-04-10 09:20:23
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lomis

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 王忆楠yn at 2015-04-10 09:20:23
谢谢！我试过新鲜的模板，cytb扩的条带特别好，而且测序也很成功 ！但是旧的模板有时候会出现非常微弱的条带，大多没有条带。前几天做了个二次pcr发现出现条带，但是分子量好像小了一点。不知道是什么因素？
...

非特异性条带，PCR中经常会出现类似问题，可通过延长引物长度来解决。
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没有命运，只有选择！
4楼2015-04-10 09:22:43
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王忆楠yn

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lomis at 2015-04-10 09:22:43
非特异性条带，PCR中经常会出现类似问题，可通过延长引物长度来解决。...

那我要换引物？or重新设置引物？这个引物是从文献上找的，别人能扩出来，我应该也扩的出来。

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2015-04-10 10:13:13
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lomis

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 王忆楠yn at 2015-04-10 10:13:13
那我要换引物？or重新设置引物？这个引物是从文献上找的，别人能扩出来，我应该也扩的出来。
...

尽信书不如无书，你既然没有做出来就应该想想问题怎么解决。
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没有命运，只有选择！
6楼2015-04-10 16:10:53
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sh_9153

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-04-11 22:09:26
条带暗有可能是你引物问题，错配率高，由于你用其它模板可以扩出目的条带，证明引物自身没有问题，只有可能是引物和模板结合问题，或者是模板本身问题
1.尝试再一次降低退火温度，看是否能扩出来
2.重新设计引物，或者增加引物长度，提高引物特异性
3.认真检测一下模板，确定模板没有问题
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王忆楠yn
7楼2015-04-10 16:26:40
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王忆楠yn

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lomis at 2015-04-10 16:10:53
尽信书不如无书，你既然没有做出来就应该想想问题怎么解决。...

谨记
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8楼2015-04-10 22:11:18
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王忆楠yn

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
7楼: Originally posted by sh_9153 at 2015-04-10 16:26:40
条带暗有可能是你引物问题，错配率高，由于你用其它模板可以扩出目的条带，证明引物自身没有问题，只有可能是引物和模板结合问题，或者是模板本身问题
1.尝试再一次降低退火温度，看是否能扩出来
2.重新设计引物， ...

我在等2次pcr测序结果，如果测的出，说明模板还是可以用的。我改变过很多次退火温度，但是找不到一个合适的退火温度，因为在上述哪个温度都出现过条带，而且都比较好。至于改变引物的话，比较麻烦，而且我是本科生，很快就面临实习，所以，这个方法我觉得对我可行性不太高。
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9楼2015-04-10 22:21:00
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