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zy99900810

木虫 (小有名气)

[求助] 大片段于载体的连接问题

本人新手,最近在做片段的连接转化,载体是T载体,自己已经往上面连接了一个大约5.5kb的片段,现在还想继续连接一个3.5kb的片段,转化提取质粒发现不但3.5kb的片段没连上,之前的5.5kb片段也消失了即又变成了空载体,质粒提取手提与盒子都试过,我用的感受态是DH5α,有对照,转化过程应该没有问题,是不是挑取菌落振摇的转数与温度有问题,我用的是150转,33度,振摇过夜。另外,如果换用top10感受态会不会解决这一问题,求大神解答,谢谢!
补充:连接过程选择酶切位点均正常切开无甲基化现象,且载体均经过CIAP处理。
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