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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 大片段于载体的连接问题
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zy99900810

木虫 (小有名气)

[求助] 大片段于载体的连接问题

本人新手，最近在做片段的连接转化，载体是T载体，自己已经往上面连接了一个大约5.5kb的片段，现在还想继续连接一个3.5kb的片段，转化提取质粒发现不但3.5kb的片段没连上，之前的5.5kb片段也消失了即又变成了空载体，质粒提取手提与盒子都试过，我用的感受态是DH5α，有对照，转化过程应该没有问题，是不是挑取菌落振摇的转数与温度有问题，我用的是150转，33度，振摇过夜。另外，如果换用top10感受态会不会解决这一问题，求大神解答，谢谢！
补充：连接过程选择酶切位点均正常切开无甲基化现象，且载体均经过CIAP处理。
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1楼 2015-04-09 14:38:33
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