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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 如何电转GS115
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胡祥祥

新虫 (小有名气)

[求助] 如何电转GS115 已有2人参与

各位大神 ，我是新手，求指教。
        我用的是ppic9k的质粒载体与目的基因融合表达载体，然后倒入TOP10中，然后培养，双酶切和测序都是对的，就是倒入到GS115这一步没有做好，我想请问你们我哪里做错了。
                       1、提取质粒，每个EP管重复3次，含有质粒的大肠菌液，所以DNA的浓度比较高。
                        2、线性化质粒。做的是100ul的体系，酶切1.5小时，（SACI酶）然后取出3ul跑胶，与原来的相比跑的条带比较靠前，证明了线性化完成。
                       3、将100ul的体系中加入300dd水和400ul 酚氯仿，剧烈震荡1min，然后离心10min，然后取出上清液，加入到新的ep管中。加入400ul的异丙醇和40ul的醋酸钠，在-20度静置1.5小时。后，离心12000rpm/10min，有明显的沉淀。到掉上清，加入1ml的70%乙醇，离心10min，到在超净台倒掉。空干30min。30min后加入10ul的无菌dd水，置于冰上待用。
                     4，感受态的制备，取GS115的单菌落，放到50ml的YPD，然后放在摇床30度，180rpm。24h后，取出2ml放入一个新到YPD培养基。3h后，测量OD600=1，然后将YPD溶液倒入两个灭菌好的塑料试管中，4000rpm/5min，倒掉上清,然后加入25ml的无菌dd水，重悬后，4000rpm/5min, 倒掉上清,然后加入15ml的无菌dd水，重悬后，4000rpm/5min,倒掉上清,然后加入10ml的无菌1M/L山梨醇，重悬后，4000rpm/5min,倒掉上清,加入700ul的山梨醇，将两个试管混合后转移到ep管中，放在冰上代用，（操作基本上在冰上进行）。
                    5电转   取80ul的感受态与10ul的质粒混合后，放在冰上预冷5min，然后立即点击（电转杯是1mm的，电压是0.9KV。时间是5.4ms。）然后立即加入1ml的山梨醇。混合后转移到一个无菌的ep管中。30度不震荡，2h，然后涂MD平板，（没有加G148、和加G418的量分别是2mg/ml和 4mg/ml）3天后，没有长出来，但是半个月后长出一些菌落，挑去一些菌落取培养，发现没有目的的蛋白质，求大神指教。。。。跪求！！！！
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要做牛a与牛c之间的人
1楼 2015-04-04 16:14:57
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lanying990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Dearstar at 2015-06-04 09:59:01
有几个建议：
1，第三部的线性化后纯化其实可以省略，尤其是这一步如果残存乙醇，对电导是非常不利，尽量蒸发时间久一点。然后你在加入10ul水重新溶解后，有没有电泳确定里面一定收集到了你的DNA呢。楼主也没有说感 ...

前面步骤基本一样，电压也是1.5kv,我做了好久没有做出来东西，最后CK在MD上都长满了菌落，有建议说有可能是山梨醇有问题需要重新配制，想请教山梨醇的配制方法？求指教
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4楼2015-07-23 20:44:30
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Dearstar

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

有几个建议：
1，第三部的线性化后纯化其实可以省略，尤其是这一步如果残存乙醇，对电导是非常不利，尽量蒸发时间久一点。然后你在加入10ul水重新溶解后，有没有电泳确定里面一定收集到了你的DNA呢。楼主也没有说感受态是取多少菌液，浓缩到最后 70ul。量不要太多，按操作手册比例来制作转化效率还是较高的。
2.我们电导一般取的压力是1.5kv，电导之前电转杯也一定要预冷，我们通常是直接放到电转杯里预冷，然后再电转，是电转完了之后要立即加入山梨醇。
3.涂平板后，尤其是MD平板上5D内没有长出来的，后面的基本上不可信了。建议先只涂MD平板，然后再转到低浓度G418.
楼主共勉~
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2楼2015-06-04 09:59:01
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380218013

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

您好，不知道能否赠送点ppIC9k的质粒？我这里有ppICA和ppICaA的质粒，如果需要可以交换。谢谢
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好好生活，努力赚钱
3楼2015-07-22 13:02:42
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
4楼: Originally posted by lanying990 at 2015-07-23 20:44:30
前面步骤基本一样，电压也是1.5kv,我做了好久没有做出来东西，最后CK在MD上都长满了菌落，有建议说有可能是山梨醇有问题需要重新配制，想请教山梨醇的配制方法？求指教...

山梨醇就是1M的，我转化成功了，PCR有目的条带。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2015-07-23 23:22:33
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