应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 如何电转GS115
21/1返回列表
查看: 1917  |  回复: 4
查看全部回帖 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

胡祥祥

新虫 (小有名气)

[求助] 如何电转GS115 已有2人参与

各位大神 ，我是新手，求指教。
        我用的是ppic9k的质粒载体与目的基因融合表达载体，然后倒入TOP10中，然后培养，双酶切和测序都是对的，就是倒入到GS115这一步没有做好，我想请问你们我哪里做错了。
                       1、提取质粒，每个EP管重复3次，含有质粒的大肠菌液，所以DNA的浓度比较高。
                        2、线性化质粒。做的是100ul的体系，酶切1.5小时，（SACI酶）然后取出3ul跑胶，与原来的相比跑的条带比较靠前，证明了线性化完成。
                       3、将100ul的体系中加入300dd水和400ul 酚氯仿，剧烈震荡1min，然后离心10min，然后取出上清液，加入到新的ep管中。加入400ul的异丙醇和40ul的醋酸钠，在-20度静置1.5小时。后，离心12000rpm/10min，有明显的沉淀。到掉上清，加入1ml的70%乙醇，离心10min，到在超净台倒掉。空干30min。30min后加入10ul的无菌dd水，置于冰上待用。
                     4，感受态的制备，取GS115的单菌落，放到50ml的YPD，然后放在摇床30度，180rpm。24h后，取出2ml放入一个新到YPD培养基。3h后，测量OD600=1，然后将YPD溶液倒入两个灭菌好的塑料试管中，4000rpm/5min，倒掉上清,然后加入25ml的无菌dd水，重悬后，4000rpm/5min, 倒掉上清,然后加入15ml的无菌dd水，重悬后，4000rpm/5min,倒掉上清,然后加入10ml的无菌1M/L山梨醇，重悬后，4000rpm/5min,倒掉上清,加入700ul的山梨醇，将两个试管混合后转移到ep管中，放在冰上代用，（操作基本上在冰上进行）。
                    5电转   取80ul的感受态与10ul的质粒混合后，放在冰上预冷5min，然后立即点击（电转杯是1mm的，电压是0.9KV。时间是5.4ms。）然后立即加入1ml的山梨醇。混合后转移到一个无菌的ep管中。30度不震荡，2h，然后涂MD平板，（没有加G148、和加G418的量分别是2mg/ml和 4mg/ml）3天后，没有长出来，但是半个月后长出一些菌落，挑去一些菌落取培养，发现没有目的的蛋白质，求大神指教。。。。跪求！！！！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白表达纯化鉴定精华

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
要做牛a与牛c之间的人
1楼 2015-04-04 16:14:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
引用回帖:
4楼: Originally posted by lanying990 at 2015-07-23 20:44:30
前面步骤基本一样，电压也是1.5kv,我做了好久没有做出来东西，最后CK在MD上都长满了菌落，有建议说有可能是山梨醇有问题需要重新配制，想请教山梨醇的配制方法？求指教...

山梨醇就是1M的，我转化成功了，PCR有目的条带。
赞一下 回复此楼
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2015-07-23 23:22:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 胡祥祥 的主题更新
21/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿西南大学生物学学硕344 求生物学相关调剂/生物与医药 +4 超人不会飞@ 2026-04-08 4/200 2026-04-08 21:18 by 学员tURuqU
[考研] 专硕310求调剂 +7 捞捞我…. 2026-04-04 8/400 2026-04-08 20:24 by yutian743
[考研] 一志愿华南师范大学-22408计算机-292分-求华南师范大学调剂 +5 爱读书的小鳄鱼 2026-04-02 5/250 2026-04-08 14:55 by CAS小花工
[考研] 275 求调剂 +8 Lei812514 2026-04-07 8/400 2026-04-08 12:46 by chemisry
[考研] 本科郑州大学，一志愿华东师范大学282求调剂 +21 熊哥xtk 2026-04-07 24/1200 2026-04-08 09:48 by 123考研123
[考研] 263分B区求调剂 +6 李nihao 2026-04-08 6/300 2026-04-08 09:38 by 南开小綦
[考研] 作栽330调剂 +3 我要上好学 2026-04-02 4/200 2026-04-07 19:54 by biomichael
[考研] 287分求调剂 有专利国奖一志愿哈工大085406 +6 白易辰 2026-04-06 7/350 2026-04-06 22:46 by 875465
[考研] 304求调剂 +4 luoye0105 2026-04-05 4/200 2026-04-06 21:05 by 木子君1218
[考研] 一志愿安徽某211 0703化学总分339求调剂 +7 晚风不晚 2026-04-04 7/350 2026-04-06 14:06 by houyaoxu
[考研] 319求调剂 +3 handrui 2026-04-05 3/150 2026-04-06 09:33 by jp9609
[考研] 调剂 +3 李广火 2026-04-05 3/150 2026-04-05 18:57 by 蓝云思雨
[考研] 295求调剂 +8 FZAC123 2026-04-03 8/400 2026-04-05 17:46 by 蓝云思雨
[考研] 313求调剂 +5 海日海日 2026-04-04 7/350 2026-04-05 13:58 by imissbao
[考研] 294求调剂 +6 Grey_Ey 2026-04-02 9/450 2026-04-04 22:07 by hemengdong
[考研] 359求调剂 +7 hhhhaaaa$ 2026-04-04 7/350 2026-04-04 18:49 by imissbao
[考研] 334求调剂 +8 曾仰之 2026-04-03 8/400 2026-04-04 11:16 by w_xuqing
[考研] 400分求调剂 +3 尴尬且挠头 2026-04-04 3/150 2026-04-04 08:41 by jp9609
[考研] 338求调剂 +7 晟功? 2026-04-03 7/350 2026-04-03 16:46 by wxiongid
[考研] 求调剂 +3 心想事成可 2026-04-03 3/150 2026-04-03 11:22 by wangjy2002
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭