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如何电转GS115 已有2人参与
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各位大神 ，我是新手，求指教。 我用的是ppic9k的质粒载体与目的基因融合表达载体，然后倒入TOP10中，然后培养，双酶切和测序都是对的，就是倒入到GS115这一步没有做好，我想请问你们我哪里做错了。 1、提取质粒，每个EP管重复3次，含有质粒的大肠菌液，所以DNA的浓度比较高。 2、线性化质粒。做的是100ul的体系，酶切1.5小时，（SACI酶）然后取出3ul跑胶，与原来的相比跑的条带比较靠前，证明了线性化完成。 3、将100ul的体系中加入300dd水和400ul 酚氯仿，剧烈震荡1min，然后离心10min，然后取出上清液，加入到新的ep管中。加入400ul的异丙醇和40ul的醋酸钠，在-20度静置1.5小时。后，离心12000rpm/10min，有明显的沉淀。到掉上清，加入1ml的70%乙醇，离心10min，到在超净台倒掉。空干30min。30min后加入10ul的无菌dd水，置于冰上待用。 4，感受态的制备，取GS115的单菌落，放到50ml的YPD，然后放在摇床30度，180rpm。24h后，取出2ml放入一个新到YPD培养基。3h后，测量OD600=1，然后将YPD溶液倒入两个灭菌好的塑料试管中，4000rpm/5min，倒掉上清,然后加入25ml的无菌dd水，重悬后，4000rpm/5min, 倒掉上清,然后加入15ml的无菌dd水，重悬后，4000rpm/5min,倒掉上清,然后加入10ml的无菌1M/L山梨醇，重悬后，4000rpm/5min,倒掉上清,加入700ul的山梨醇，将两个试管混合后转移到ep管中，放在冰上代用，（操作基本上在冰上进行）。 5电转 取80ul的感受态与10ul的质粒混合后，放在冰上预冷5min，然后立即点击（电转杯是1mm的，电压是0.9KV。时间是5.4ms。）然后立即加入1ml的山梨醇。混合后转移到一个无菌的ep管中。30度不震荡，2h，然后涂MD平板，（没有加G148、和加G418的量分别是2mg/ml和 4mg/ml）3天后，没有长出来，但是半个月后长出一些菌落，挑去一些菌落取培养，发现没有目的的蛋白质，求大神指教。。。。跪求！！！！ |
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【答案】应助回帖
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有几个建议： 1，第三部的线性化后纯化其实可以省略，尤其是这一步如果残存乙醇，对电导是非常不利，尽量蒸发时间久一点。然后你在加入10ul水重新溶解后，有没有电泳确定里面一定收集到了你的DNA呢。楼主也没有说感受态是取多少菌液，浓缩到最后 70ul。量不要太多，按操作手册比例来制作转化效率还是较高的。 2.我们电导一般取的压力是1.5kv，电导之前电转杯也一定要预冷，我们通常是直接放到电转杯里预冷，然后再电转，是电转完了之后要立即加入山梨醇。 3.涂平板后，尤其是MD平板上5D内没有长出来的，后面的基本上不可信了。建议先只涂MD平板，然后再转到低浓度G418. 楼主共勉~ |
2楼2015-06-04 09:59:01
380218013
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3楼2015-07-22 13:02:42
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4楼2015-07-23 20:44:30
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5楼2015-07-23 23:22:33
