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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » 枯草基因敲除
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huantao12

金虫 (小有名气)

[求助] 枯草基因敲除 已有2人参与

各位大神，小弟最近刚涉及分子生物学，想咨询一下各位。在做枯草的基因敲除时，有没有比较好的体系，或者质粒什么的。由于实验室的敲出体系用的是Sac B 基因作为反向筛选的，不知道还有没别的比较好的手段作为反向筛选压力的。小弟非常期待你们的答复。。。
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1楼 2015-04-04 10:29:48
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

liygmail

至尊木虫 (职业作家)
负筛选标记基因有mazF和upp
用含有正、负筛选标记基因以及同源臂的自杀质粒和线性DNA可进行基因无痕敲除，原理略有不同：
以自杀质粒敲除采用的两次前后两次单交换；
利用线性DNA盒子敲除涉及一次双交换和一次单交换，双交换概率较低
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8楼2015-04-06 00:23:13
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
huantao12: 金币+10, ★★★很有帮助, 可否再详细一点啊？ 2015-04-04 14:51:04
就是用pk18mobsacb

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2楼2015-04-04 11:14:55
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199006287956

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们做的基因敲除，用的DNA片段作为敲除盒，没有用到质粒。

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huantao12
追求不惜，奋斗不息
3楼2015-04-04 14:10:53
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huantao12

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by 199006287956 at 2015-04-04 14:10:53
我们做的基因敲除，用的DNA片段作为敲除盒，没有用到质粒。

可否在像一点啊，非常感谢？
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4楼2015-04-04 14:51:33
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199006287956

木虫 (著名写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-04-05 22:27:28
引用回帖:
4楼: Originally posted by huantao12 at 2015-04-04 14:51:33
可否在像一点啊，非常感谢？...

原理都是同源重组，我们把一种抗性基因的两端连上目的基因两端的相同DNA片段。利用这种抗性基因片段敲掉目的片段。达到这些目的，需要用到融合Pcr等。

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追求不惜，奋斗不息
5楼2015-04-04 15:16:44
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bolysu

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
6楼2015-04-04 16:14:40
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199006287956

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bolysu at 2015-04-04 16:14:40
但是我们也是用这样的方法，但是始终不成功，你的同源臂是多长啊？需要进行甲基化吗...

没有，我们没有甲级化。左右臂长度各有1800bp左右。

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追求不惜，奋斗不息
7楼2015-04-04 19:56:18
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huantao12

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by liygmail at 2015-04-06 00:23:13
负筛选标记基因有mazF和upp
用含有正、负筛选标记基因以及同源臂的自杀质粒和线性DNA可进行基因无痕敲除，原理略有不同：
以自杀质粒敲除采用的两次前后两次单交换；
利用线性DNA盒子敲除涉及一次双交换和一次单 ...

非常感谢，还想请问一下，这两个基因的启动子有特别的要求吗？
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9楼2015-04-06 14:06:27
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liygmail

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
9楼: Originally posted by huantao12 at 2015-04-06 14:06:27
非常感谢，还想请问一下，这两个基因的启动子有特别的要求吗？...

mazF和upp可以选择诱导表达或组成性表达
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10楼2015-04-07 03:42:12
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