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浣花道人

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 293细胞冻存和复苏

新手,很着急!!!想请教给位一个问题,最近我一直在养293细胞,之前从别人那里要来一株冻存的293细胞,正常复苏(1000rpm离心,悬浮,培养)养的很好,等细胞长得差不多了的时候,我就冻存了,将培养基倒掉后,加胰酶消化30s,然后悬浮,离心,弃去培养基,用冻存液悬浮(90%小牛血清+10%DMSO),然后放在冻存盒里-80冻存,第二天液氮,然后我选了一只复苏,却发现细胞没有之前正常的293细胞的形态,都是大的圆形的贴壁细胞,长得都不正常,非常着急,已经好几次都是这样了,请给我帮我出出主意,到底是哪出的问题?
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wanglele87

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

用胰酶消化后,我会用培养基洗一下细胞。洗去残余胰酶和一些细胞碎片。这是其一。
其二细胞冻存和复苏需要慢冻快化。楼主直接放负八十比较不可理。我建议先放到四度几个小时,然后再转到负二十过半天到一天,然后再负八十放上一两天,然后转液氮。
一生不羁放纵爱自由
2楼2015-03-05 10:10:11
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364123299

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主,冻得太快。我们一般包上一坨棉花放到负八十过夜,第二天再放液氮
3楼2015-03-05 14:02:58
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cclandrover

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wanglele87 at 2015-03-05 10:10:11
用胰酶消化后,我会用培养基洗一下细胞。洗去残余胰酶和一些细胞碎片。这是其一。
其二细胞冻存和复苏需要慢冻快化。楼主直接放负八十比较不可理。我建议先放到四度几个小时,然后再转到负二十过半天到一天,然后再 ...

用胰酶消化之后细胞都悬浮了,用培养基洗的话就都洗没了啊。。。。。。
4楼2015-03-05 15:48:10
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wanglele87

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by cclandrover at 2015-03-05 15:48:10
用胰酶消化之后细胞都悬浮了,用培养基洗的话就都洗没了啊。。。。。。...

通过离心,重悬来洗啊。。。关于冻存,有卖的专门的冻存盒,一小时降一度。。还有就是一定要传几代到细胞状态最好的时候冻存。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

一生不羁放纵爱自由
5楼2015-03-05 18:47:06
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hbl215

金虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

怎么大家都说冻得太快,都没看清楚陈述。如果你所谓的冻存盒是程序降温盒,那就没错,整个描述看起来操作都没错,那只可能出在细节上。比如消化确实没过头,复苏时动作够快,水浴锅温度38度至40度,刚复苏离心力小一点,确保去除DMSO,弃取上清后吹散细胞动作也温柔点。你要回忆每一步可能有问题的地方啊,甚至试剂有没有配错,等等。细胞操作虽然简单,但是要做好的话,细节很重要,祝好运

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

6楼2015-03-05 19:33:58
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浣花道人

铁杆木虫 (正式写手)

送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by hbl215 at 2015-03-05 19:33:58
怎么大家都说冻得太快,都没看清楚陈述。如果你所谓的冻存盒是程序降温盒,那就没错,整个描述看起来操作都没错,那只可能出在细节上。比如消化确实没过头,复苏时动作够快,水浴锅温度38度至40度,刚复苏离心力小一 ...

谢谢,你真的很懂我的意思,我好好再检查一遍,哈哈 谢谢啦
7楼2015-03-09 09:14:28
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浣花道人

铁杆木虫 (正式写手)

送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by wanglele87 at 2015-03-05 18:47:06
通过离心,重悬来洗啊。。。关于冻存,有卖的专门的冻存盒,一小时降一度。。还有就是一定要传几代到细胞状态最好的时候冻存。...

恩恩,谢谢啦 很详细
8楼2015-03-09 09:15:02
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jora0418

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可以用冻存盒,冻存盒的话可以直接放负80里面。
9楼2015-12-03 18:43:26
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