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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 网络生活区 » 有奖问答 » 学术帮助 » 293细胞冻存和复苏
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浣花道人

铁杆木虫 (正式写手)

[求助] 293细胞冻存和复苏

新手，很着急！！！想请教给位一个问题，最近我一直在养293细胞，之前从别人那里要来一株冻存的293细胞，正常复苏（1000rpm离心，悬浮，培养）养的很好，等细胞长得差不多了的时候，我就冻存了，将培养基倒掉后，加胰酶消化30s，然后悬浮，离心，弃去培养基，用冻存液悬浮（90%小牛血清+10%DMSO），然后放在冻存盒里-80冻存，第二天液氮，然后我选了一只复苏，却发现细胞没有之前正常的293细胞的形态，都是大的圆形的贴壁细胞，长得都不正常，非常着急，已经好几次都是这样了，请给我帮我出出主意，到底是哪出的问题？
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1楼 2015-03-05 09:00:43
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wanglele87

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

用胰酶消化后，我会用培养基洗一下细胞。洗去残余胰酶和一些细胞碎片。这是其一。
其二细胞冻存和复苏需要慢冻快化。楼主直接放负八十比较不可理。我建议先放到四度几个小时，然后再转到负二十过半天到一天，然后再负八十放上一两天，然后转液氮。
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一生不羁放纵爱自由
2楼2015-03-05 10:10:11
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364123299

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼主，冻得太快。我们一般包上一坨棉花放到负八十过夜，第二天再放液氮
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3楼2015-03-05 14:02:58
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cclandrover

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wanglele87 at 2015-03-05 10:10:11
用胰酶消化后，我会用培养基洗一下细胞。洗去残余胰酶和一些细胞碎片。这是其一。
其二细胞冻存和复苏需要慢冻快化。楼主直接放负八十比较不可理。我建议先放到四度几个小时，然后再转到负二十过半天到一天，然后再 ...

用胰酶消化之后细胞都悬浮了，用培养基洗的话就都洗没了啊。。。。。。
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4楼2015-03-05 15:48:10
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wanglele87

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by cclandrover at 2015-03-05 15:48:10
用胰酶消化之后细胞都悬浮了，用培养基洗的话就都洗没了啊。。。。。。...

通过离心，重悬来洗啊。。。关于冻存，有卖的专门的冻存盒，一小时降一度。。还有就是一定要传几代到细胞状态最好的时候冻存。
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浣花道人
一生不羁放纵爱自由
5楼2015-03-05 18:47:06
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hbl215

金虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

怎么大家都说冻得太快，都没看清楚陈述。如果你所谓的冻存盒是程序降温盒，那就没错，整个描述看起来操作都没错，那只可能出在细节上。比如消化确实没过头，复苏时动作够快，水浴锅温度38度至40度，刚复苏离心力小一点，确保去除DMSO，弃取上清后吹散细胞动作也温柔点。你要回忆每一步可能有问题的地方啊，甚至试剂有没有配错，等等。细胞操作虽然简单，但是要做好的话，细节很重要，祝好运
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浣花道人
6楼2015-03-05 19:33:58
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浣花道人

铁杆木虫 (正式写手)
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引用回帖:
6楼: Originally posted by hbl215 at 2015-03-05 19:33:58
怎么大家都说冻得太快，都没看清楚陈述。如果你所谓的冻存盒是程序降温盒，那就没错，整个描述看起来操作都没错，那只可能出在细节上。比如消化确实没过头，复苏时动作够快，水浴锅温度38度至40度，刚复苏离心力小一 ...

谢谢，你真的很懂我的意思，我好好再检查一遍，哈哈 谢谢啦
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7楼2015-03-09 09:14:28
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浣花道人

铁杆木虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by wanglele87 at 2015-03-05 18:47:06
通过离心，重悬来洗啊。。。关于冻存，有卖的专门的冻存盒，一小时降一度。。还有就是一定要传几代到细胞状态最好的时候冻存。...

恩恩，谢谢啦 很详细
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8楼2015-03-09 09:15:02
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jora0418

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

可以用冻存盒，冻存盒的话可以直接放负80里面。
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9楼2015-12-03 18:43:26
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