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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » RAW264.7细胞的培养问题-----传代、冻存和复苏
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风中的羽翼_

铜虫 (小有名气)

[求助] RAW264.7细胞的培养问题-----传代、冻存和复苏 已有1人参与

RAW264.7细胞的培养总遇到问题。
这个细胞我是从别人那里要的。
第一次要来之后，冻存了一批，在-80℃中可以复苏成功，于是把种子细胞扔掉了，并且把冻存细胞转入液氮。后来药品到了，复苏细胞做实验时，却怎么都不能成功。
第二次厚着脸皮跟别人又要来一次，回来了大量扩增冻存，转入液氮。这次留了一个心眼，种子细胞没有丢掉。但是现在转入液氮的细胞怎么都不能复苏成功，种子细胞已经传到10次以上，生长速度变得很慢，状态倒是还可以。

有没有在培养RAW264.7细胞方面很有经验的前辈给我传授下经验？？本人万分感谢。

我的传代方法：弃去旧培养液，加入新鲜的培养液，用移液器反复吹打，然后一分为二转至两个新平皿，每皿补足5ml的培养体积。
我的冻存方法： 冻存液是血清：DMSO=9:1。冻存采用  4℃20min, -20℃20min,-80℃过夜，然后转入液氮。
我的复苏方法：从液氮中取出冻存的细胞，37-39℃下快速融化冻存的细胞液，用PBS缓冲液1500rpm离心3min，弃上清，用5ml培养基将细胞沉淀吹匀。

每次从液氮中复苏的细胞都死掉，几乎不能存活。但是之前有一次从-80℃中却可以成功复苏。现在等着用它来多肽对内毒素的抑制活性，愁死了。
希望好心人帮一下。
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1楼 2013-06-20 15:58:54
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

vivien520584

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
风中的羽翼_: 金币+1 2013-10-18 10:39:54
我之前也养过Raw264.7的细胞，冻存和复苏的方法和你都有点不同
冻存时冻存液为50%血清，10%DMSO，40%培养基，放入冻存盒后4℃30min，直接转入-80℃，过夜后转入液氮。
复苏时 将液氮中细胞直接放入37℃左右水浴中快速解冻，后加入5倍体积培养基，800rpm离心3min，转入培养瓶中培养。
成功率基本上99.9%，没什么问题。
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6楼2013-10-18 09:58:40
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yjhcqmu

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

复苏时，融化后应该加完全培养基，而且要加10倍保存液体积的培养基，而不是pbs
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5楼2013-10-17 22:17:42
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1.复苏时，在水浴中的冻存管有没有爆裂？
2.冻存时只用血清和DMSO吗?不加入培养基？
3.离心上清中是否有细胞碎片？
4.冻存前细胞有没有培养一下？
5.如果-80℃可以，那建议为了实验，先放-80℃里用着。液氮只是为了长期保存。
搞明白这些问题，基本就找到原因了。
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2楼2013-06-20 16:05:42
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tjkyk

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你的冻存方法可能有问题。冻存液应该有培养液、血清、DMSO，没有培养液，细胞当然不能活了。
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3楼2013-06-21 09:06:23
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爱知识-圆圆

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
风中的羽翼_: 金币+1 2013-10-18 10:46:22
我也觉得是你的冻存液的问题。
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whatever I do,do my best!
4楼2013-06-21 10:11:56
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胜骑灵人

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我养这个细胞的时候，复苏的时候应该轻轻加入培养液，轻轻吹打，离心转数也应该在800转一下，离心时间短一些，而且放入小培养瓶中培养
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7楼2013-10-18 13:45:08
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erin0208

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

嗨，不知道你现在细胞养得怎么样了，我的细胞出现了和你一样的问题，不知你最后怎么解决的
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8楼2014-02-19 14:19:36
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风中的羽翼_

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by erin0208 at 2014-02-19 14:19:36
嗨，不知道你现在细胞养得怎么样了，我的细胞出现了和你一样的问题，不知你最后怎么解决的

换了新的细胞来源
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9楼2014-02-25 08:37:02
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haoyangguang

新虫 (初入文坛)
请问您这个问题解决了吗？我也遇到了类似的问题。
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10楼2015-01-16 21:36:35
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