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风中的羽翼_

铜虫 (小有名气)

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[求助] RAW264.7细胞的培养问题-----传代、冻存和复苏已有1人参与

RAW264.7细胞的培养总遇到问题。
这个细胞我是从别人那里要的。
第一次要来之后，冻存了一批，在-80℃中可以复苏成功，于是把种子细胞扔掉了，并且把冻存细胞转入液氮。后来药品到了，复苏细胞做实验时，却怎么都不能成功。
第二次厚着脸皮跟别人又要来一次，回来了大量扩增冻存，转入液氮。这次留了一个心眼，种子细胞没有丢掉。但是现在转入液氮的细胞怎么都不能复苏成功，种子细胞已经传到10次以上，生长速度变得很慢，状态倒是还可以。

有没有在培养RAW264.7细胞方面很有经验的前辈给我传授下经验？？本人万分感谢。

我的传代方法：弃去旧培养液，加入新鲜的培养液，用移液器反复吹打，然后一分为二转至两个新平皿，每皿补足5ml的培养体积。
我的冻存方法：冻存液是血清：DMSO=9:1。冻存采用 4℃20min, -20℃20min,-80℃过夜，然后转入液氮。
我的复苏方法：从液氮中取出冻存的细胞，37-39℃下快速融化冻存的细胞液，用PBS缓冲液1500rpm离心3min，弃上清，用5ml培养基将细胞沉淀吹匀。

每次从液氮中复苏的细胞都死掉，几乎不能存活。但是之前有一次从-80℃中却可以成功复苏。现在等着用它来多肽对内毒素的抑制活性，愁死了。
希望好心人帮一下。

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1楼2013-06-20 15:58:54

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vivien520584

新虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★
风中的羽翼_: 金币+1 2013-10-18 10:39:54

我之前也养过Raw264.7的细胞，冻存和复苏的方法和你都有点不同
冻存时冻存液为50%血清，10%DMSO，40%培养基，放入冻存盒后4℃30min，直接转入-80℃，过夜后转入液氮。
复苏时将液氮中细胞直接放入37℃左右水浴中快速解冻，后加入5倍体积培养基，800rpm离心3min，转入培养瓶中培养。
成功率基本上99.9%，没什么问题。