| 查看: 3431 | 回复: 9 | ||
[求助]
HepG2细胞复苏不成功，求解!
|
||
给位大侠帮帮我吧！我2013年4月8日冻存的HepG2细胞6月8日去复苏，没有复苏成功。我冻存时冻存液的比例是DMEM:胎牛血清 MSO=7:2:1，冻存过程是：消化-离心-冻存液重悬-移至冻存管中，4度30分钟，-20度近两个小时，然后一直放在-70度中。复苏时快速放置40度水浴锅中2分钟内溶解，没有离心直接加培基5ML，结果晚上看还没有贴壁，后来一直没有贴壁。我以为是我冻存时操作问题或是我没有离心的原因等。我要我同学拿她的HepG2细胞复苏。他的细胞大概在3月份冻的，冻存的操作和冻存液我们的是一样的。复苏时她离心了，500rpf, 5 min。其余操作一样。结果还是没有复苏成功。 但是我还有一个同学，虽然跟我养的不是一样的细胞，但是所有的冻存液和冻存方法一致，但是她的就复苏成功了。 这到底是什么原因呀？望各位大侠帮我分析分析吧 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有144人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- IgM抗体用CHO细胞表达不出（IgG已经成功表达）
已经有8人回复
- HepG2细胞培养出现的问题
已经有6人回复
- 请问用不加血清的DMEM培养基时，HepG2细胞还会长么，数目会变多么？
已经有16人回复
- 求助：测定HepG2细胞功能之白蛋白分泌
已经有5人回复
- HepG2传代培养问题
已经有7人回复
- HepG2细胞培养
已经有16人回复
- 小鼠肝癌细胞Hepa1c1c7和人肝癌细胞HepG2的购买
已经有5人回复
- 人肝癌细胞 SK-HEP-1复苏后的培养
已经有5人回复
- 现在有一批HepG2细胞，想要提取出细胞中的细胞核，线粒体，溶酶体，如何实现？
已经有10人回复
- Hepg2图片
已经有8人回复
- 为什么我做禽流感H9型感染MDCK细胞不成功？
已经有7人回复
- 【求助】成都哪里有HepG2,A549细胞，急求!
已经有3人回复
- 【求助/交流】细胞复苏不成功，出现了一些问题。
已经有14人回复
- 【求助/交流】HepG2细胞消化酶的选择
已经有6人回复
- 【求助/交流】无血清培养HepG2细胞的时间
已经有7人回复
myprayer
专家顾问 (著名写手)
- MolEPI: 12
- 应助: 81 (初中生)
- 贵宾: 2.822
- 金币: 32408.7
- 散金: 1696
- 红花: 159
- 沙发: 3
- 帖子: 2275
- 在线: 822.5小时
- 虫号: 1759711
- 注册: 2012-04-16
- 专业: 生物力学与生物流变学
- 管辖: 生物医药区
【答案】应助回帖
★ ★ ★
myprayer: 回帖置顶 2013-06-19 17:23:54
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-06-19 21:32:59
myprayer: 回帖置顶 2013-06-19 17:23:54
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-06-19 21:32:59
|
我们实验室也在培养HEPG2 ，我们遵循的protocol是这样子的： 细胞的冻存 1.先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。 2.接着置于-20℃冰箱，约30-60min。 3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。 4.置于液氮罐中长期保存。 5同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。 注意事项： 1.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。 2.不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。 3.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。 细胞的复苏 细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 具体操作 一. 实验前准备： 1.将水浴锅预热至37℃ 2.用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。 3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 二．取出冻存管： 1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。 2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。 三．迅速解冻： 1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。 2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。 四.平衡离心： 用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min 五.制备细胞悬液： 1.吸弃上清液。 2.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。 六.细胞计数： 细胞浓度以5×105/ml为宜。 七.培养细胞 将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。 初学者易犯错误： 1水浴锅未预热或者未预热到37℃。 2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。 3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。 4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 和我们实验室一样呀，我们也是按上述步骤操作的，就成功了。 连细胞养的都一样哈哈。期待你的成功  |
9楼2013-06-19 17:23:48
2楼2013-06-09 10:14:07
3楼2013-06-09 10:18:31
zx1984
木虫 (正式写手)
- 应助: 21 (小学生)
- 金币: 7563.2
- 散金: 2765
- 红花: 2
- 帖子: 434
- 在线: 379.3小时
- 虫号: 1176692
- 注册: 2010-12-24
- 性别: GG
- 专业: 出血、凝血与血栓
4楼2013-06-09 13:48:58
5楼2013-06-13 14:44:00
6楼2013-06-13 14:46:34
7楼2013-06-13 14:48:52
zx1984
木虫 (正式写手)
- 应助: 21 (小学生)
- 金币: 7563.2
- 散金: 2765
- 红花: 2
- 帖子: 434
- 在线: 379.3小时
- 虫号: 1176692
- 注册: 2010-12-24
- 性别: GG
- 专业: 出血、凝血与血栓
8楼2013-06-14 08:11:27
10楼2013-08-23 13:10:13
