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HepG2细胞复苏不成功，求解!
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给位大侠帮帮我吧！我2013年4月8日冻存的HepG2细胞6月8日去复苏，没有复苏成功。我冻存时冻存液的比例是DMEM:胎牛血清 MSO=7:2:1，冻存过程是：消化-离心-冻存液重悬-移至冻存管中，4度30分钟，-20度近两个小时，然后一直放在-70度中。复苏时快速放置40度水浴锅中2分钟内溶解，没有离心直接加培基5ML，结果晚上看还没有贴壁，后来一直没有贴壁。我以为是我冻存时操作问题或是我没有离心的原因等。我要我同学拿她的HepG2细胞复苏。他的细胞大概在3月份冻的，冻存的操作和冻存液我们的是一样的。复苏时她离心了，500rpf, 5 min。其余操作一样。结果还是没有复苏成功。 但是我还有一个同学，虽然跟我养的不是一样的细胞，但是所有的冻存液和冻存方法一致，但是她的就复苏成功了。 这到底是什么原因呀？望各位大侠帮我分析分析吧 |
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myprayer
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myprayer: 回帖置顶 2013-06-19 17:23:54
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-06-19 21:32:59
myprayer: 回帖置顶 2013-06-19 17:23:54
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-06-19 21:32:59
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我们实验室也在培养HEPG2 ，我们遵循的protocol是这样子的： 细胞的冻存 1.先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。 2.接着置于-20℃冰箱，约30-60min。 3.置于-80超低温冰箱中放置过夜。 4.置于液氮罐中长期保存。 5同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。 注意事项： 1.使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以至于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时最好戴上手套操作。 2.不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。 3.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。 细胞的复苏 细胞复苏的原则－快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 具体操作 一. 实验前准备： 1.将水浴锅预热至37℃ 2.用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。 3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。 二．取出冻存管： 1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。 2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。 三．迅速解冻： 1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。 2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。 四.平衡离心： 用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min 五.制备细胞悬液： 1.吸弃上清液。 2.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。 六.细胞计数： 细胞浓度以5×105/ml为宜。 七.培养细胞 将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。 初学者易犯错误： 1水浴锅未预热或者未预热到37℃。 2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。 3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。 4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。 和我们实验室一样呀，我们也是按上述步骤操作的，就成功了。 连细胞养的都一样哈哈。期待你的成功  |
9楼2013-06-19 17:23:48
2楼2013-06-09 10:14:07
3楼2013-06-09 10:18:31
zx1984
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