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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » HepG2细胞复苏不成功，求解!
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若乔西木

银虫 (初入文坛)

[求助] HepG2细胞复苏不成功，求解!

给位大侠帮帮我吧！我2013年4月8日冻存的HepG2细胞6月8日去复苏，没有复苏成功。我冻存时冻存液的比例是DMEM:胎牛血清MSO=7:2:1，冻存过程是：消化-离心-冻存液重悬-移至冻存管中，4度30分钟，-20度近两个小时，然后一直放在-70度中。复苏时快速放置40度水浴锅中2分钟内溶解，没有离心直接加培基5ML，结果晚上看还没有贴壁，后来一直没有贴壁。
      我以为是我冻存时操作问题或是我没有离心的原因等。我要我同学拿她的HepG2细胞复苏。他的细胞大概在3月份冻的，冻存的操作和冻存液我们的是一样的。复苏时她离心了，500rpf, 5 min。其余操作一样。结果还是没有复苏成功。
      但是我还有一个同学，虽然跟我养的不是一样的细胞，但是所有的冻存液和冻存方法一致，但是她的就复苏成功了。
    这到底是什么原因呀？望各位大侠帮我分析分析吧
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1楼 2013-06-09 09:56:10
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四月天fish

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我们实验室的原则是4度20min,-20度20min。-80需要过夜才能转入液氮中，一般细胞离心不要超过350rcf
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10楼2013-08-23 13:10:13
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唐朝豪放男

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
若乔西木: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-06-13 14:44:12
-20度近两个小时?!细胞复苏和冻存的关键之一就是使细胞快速度过0~-20度这个阶段，以减少冰晶的形成，但又不能过快，建议使用程序降温盒，没条件的话也可以使用棉花包裹后，4度40~60min，后直接-80，效果很好。另外不要轻易认为你和其他人的所有方法都一致，有很多细节需要观察才能发现
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2楼2013-06-09 10:14:07
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唐朝豪放男

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
1949stone: 金币+3, 鼓励交流 学习 2013-06-09 14:12:37
还有两个细节就是：1，复苏使用37度就可以啦，你以为热激大肠杆菌啊。2，复苏时最好离心去掉冻存液，DMSO也是很毒的
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3楼2013-06-09 10:18:31
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zx1984

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-13 19:27:21
可以4度10分钟，-20度30分钟，然后-80就好了，强烈建议，复苏时离心，还有37度溶解。
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4楼2013-06-09 13:48:58
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