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若乔西木

银虫 (初入文坛)

[求助] HepG2细胞复苏不成功,求解!

给位大侠帮帮我吧!我2013年4月8日冻存的HepG2细胞6月8日去复苏,没有复苏成功。我冻存时冻存液的比例是DMEM:胎牛血清MSO=7:2:1,冻存过程是:消化-离心-冻存液重悬-移至冻存管中,4度30分钟,-20度近两个小时,然后一直放在-70度中。复苏时快速放置40度水浴锅中2分钟内溶解,没有离心直接加培基5ML,结果晚上看还没有贴壁,后来一直没有贴壁。
      我以为是我冻存时操作问题或是我没有离心的原因等。我要我同学拿她的HepG2细胞复苏。他的细胞大概在3月份冻的,冻存的操作和冻存液我们的是一样的。复苏时她离心了,500rpf, 5 min。其余操作一样。结果还是没有复苏成功。
      但是我还有一个同学,虽然跟我养的不是一样的细胞,但是所有的冻存液和冻存方法一致,但是她的就复苏成功了。
    这到底是什么原因呀?望各位大侠帮我分析分析吧
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若乔西木

银虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zx1984 at 2013-06-09 13:48:58
可以4度10分钟,-20度30分钟,然后-80就好了,强烈建议,复苏时离心,还有37度溶解。

-20度30分钟也可以啊?是不是这个时间没必要控制的很严啊,因为有好多种说法
7楼2013-06-13 14:48:52
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唐朝豪放男

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
若乔西木: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-06-13 14:44:12
-20度近两个小时?!细胞复苏和冻存的关键之一就是使细胞快速度过0~-20度这个阶段,以减少冰晶的形成,但又不能过快,建议使用程序降温盒,没条件的话也可以使用棉花包裹后,4度40~60min,后直接-80,效果很好。另外不要轻易认为你和其他人的所有方法都一致,有很多细节需要观察才能发现
2楼2013-06-09 10:14:07
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唐朝豪放男

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
1949stone: 金币+3, 鼓励交流 学习 2013-06-09 14:12:37
还有两个细节就是:1,复苏使用37度就可以啦,你以为热激大肠杆菌啊。2,复苏时最好离心去掉冻存液,DMSO也是很毒的
3楼2013-06-09 10:18:31
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zx1984

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-13 19:27:21
可以4度10分钟,-20度30分钟,然后-80就好了,强烈建议,复苏时离心,还有37度溶解。
4楼2013-06-09 13:48:58
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