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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 胶回收连接问题
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涤生2013

铁虫 (小有名气)

[求助] 胶回收连接问题 已有2人参与

10K的载体分步酶切，第一次酶切后胶回收，胶回收后进行第二次酶切，然后纯化，可是纯化后电泳看不见条带，能继续做连接吗，如果可以该加多少量？万分感谢，这个克隆已经做了很久了，做的都没什么自信了，哎，烦人
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1楼 2015-01-31 16:10:39
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yongpan313

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
为什么不两次酶切后在割胶回收，如果酶切buffer不一样可以扩大体系再切，这样一次胶回收得率高。看不到也可以连接试试，我们一般都不再跑胶，直接连接。回收后载体和片段，约1:5 到1:10左右吧，祝好运。
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2楼2015-01-31 18:21:46
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13227213581

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们实验室一般是第一遍切做溶液回收，洗脱50%左右，第二次胶回收洗脱10%左右。
可能是你二次洗脱太多被稀释的看不见了。一般少于洗脱浓度小于10ng/ul 跑琼脂糖就看不到明显条带了
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justbesunshine
3楼2015-02-02 21:52:56
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