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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 向各位有经验者求助，提取DNA问题
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lazyren

铁虫 (小有名气)

[求助] 向各位有经验者求助，提取DNA问题 已有3人参与

除了白-4是外类群，其他均为同一属植物，其为灌木或乔木

实验方法是：
1.取样约0.02g，液氮研磨
2.CTAB 800微升+巯基乙醇15微升，65摄氏度温浴1小时
3.氯仿：异戊醇（24：1）洗两次，离心12000rpm，10分钟，轻摇乳化10分钟，冰浴15分钟
4.取上清，加入5M NaCl体积为上清1/5,  异丙醇（-20摄氏度）等体积加入（即上清+NaCl），冰冻3h，离心10000rpm,10分钟
5.冰冻的75%乙醇（-20摄氏度）洗两次，加500微升，离心10000rpm，10min,冰冻无水乙醇洗一次，加200微升，离心，晾干30分钟
6.TE加50微升+RNase(0.1mg/ml) 2微升，温浴37摄氏度 1小时

电泳
1%的琼脂糖凝胶，goldview 2微升/40微升TBE与琼脂糖混合液
70v，1.5h

以上，做了几次，感觉还是降解，请问有朋友能提点提点吗？

向各位有经验者求助，提取DNA问题
20150129(5).jpg
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1楼 2015-01-30 10:06:28
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看了你的提取方案，可能你的提取方法需要改进。不知道这是否是成熟的提取方法？
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4楼2015-01-30 11:16:33
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晞朔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lazyren(西门吹雪170代发): 金币+3, 鼓励回帖交流 2015-01-30 22:37:46
我提过很多植物DNA,你的样品２０ｍｇ有点少。
巯基乙醇抗氧化，千分之二就可以了。
氯仿异戊醇抽提之后，要剧烈振荡，以使抽提充分。
异丙醇沉淀，室温，十分钟后轻摇，应该即可看出丝状DNA析出。
７０％乙醇洗沉淀之后，直接晾干，加水溶解，DNA就可出来了。
当然，紧接着可以做个ＲＮａｓｅ消化。
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6楼2015-01-30 11:43:34
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普通回帖

Gin—红与黑

金虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 应助指数-1, 无应助 2015-01-30 22:37:29
第一次见这样惨不忍睹的条带。。。。

[ 发自小木虫客户端 ]
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2楼2015-01-30 10:38:14
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lazyren

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Gin—红与黑 at 2015-01-30 10:38:14
第一次见这样惨不忍睹的条带。。。。

求指导，我也不想惨不忍睹的说
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3楼2015-01-30 10:48:42
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lazyren

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-30 11:16:33
看了你的提取方案，可能你的提取方法需要改进。不知道这是否是成熟的提取方法？

是结合了两个曾经用过的实验方法修改出来的方法，请问有哪些方面可以改进？
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5楼2015-01-30 11:34:52
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lazyren

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-30 11:43:34
我提过很多植物DNA,你的样品２０ｍｇ有点少。
巯基乙醇抗氧化，千分之二就可以了。
氯仿异戊醇抽提之后，要剧烈振荡，以使抽提充分。
异丙醇沉淀，室温，十分钟后轻摇，应该即可看出丝状DNA析出。
７０％乙醇洗 ...

谢谢你的建议。

我看过有些文献是1g样品1mlCTAB, 那是否我的样品量要0.8g那么多？然后异丙醇的步骤，是否指不需要冷冻沉淀？因为提的DNA后面会做SSR，不知道用水溶解会不会保存得不好？
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7楼2015-01-30 12:03:06
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晞朔

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by lazyren at 2015-01-30 12:03:06
谢谢你的建议。

我看过有些文献是1g样品1mlCTAB, 那是否我的样品量要0.8g那么多？然后异丙醇的步骤，是否指不需要冷冻沉淀？因为提的DNA后面会做SSR，不知道用水溶解会不会保存得不好？...

可以。异丙醇沉淀室温１０－２０ｍｉｎ就可以了。最后可以用１/10TE溶解，保存相对久一点。
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8楼2015-01-30 12:13:45
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
lazyren(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-30 22:37:56
1.提取液改进
2.4步奏里面-20在20分钟以上
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9楼2015-01-30 12:36:34
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lazyren

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 晞朔 at 2015-01-30 12:13:45
可以。异丙醇沉淀室温１０－２０ｍｉｎ就可以了。最后可以用１/10TE溶解，保存相对久一点。...

好的，我试验一下，1/10 TE是指要稀释10倍吗？
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10楼2015-01-30 12:53:35
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