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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2025级博士研究生招生报考通知
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素素2008

新虫 (初入文坛)

[求助] 提取DNA出现弥散------求助

Sample TextSample Text求助:
     小虫做海洋藻类的DNA提取。虽然有条带,但是有很长的弥散拖带,求助:这是什么原因?因为DNA浓度很低,只有20ng/ml,所以模板量加的比较多。有4ul。用mix做的。引物为2ul。
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  • 2012-11-27 11:17:55, 162.77 K

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rongduoyan

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2012-11-27 20:47:52
可能是PCR时,DNA模版浓度高了,也可能是提取DNA是不纯,建议点一个对照就知道了,即为mix换成水,与图中的样本一起跑PCR ,还有如果有扩出目的条带来了话,其实有弥散没关系的,如果怕不纯,可以回收后以其为模版重新第二次PCR 就可以了!
7楼2012-11-27 16:05:55
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
样品里可能有RNA,弥散的是不完全降解的RNA吧。还有,20ng/ml好像是很低啊,确定不是20ng/ul吗?做PCR模板的话,10-50ng DNA就够了。

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2楼2012-11-27 11:56:07
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素素2008

新虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-27 11:56:07
样品里可能有RNA,弥散的是不完全降解的RNA吧。还有,20ng/ml好像是很低啊,确定不是20ng/ul吗?做PCR模板的话,10-50ng DNA就够了。

哦哦。不好意思,是20ng/ul,不小心写错了。不过,提取时加入了RNA酶的。加了两ul。不知道是不是加的少了?
3楼2012-11-27 13:13:13
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
得看你RNA酶的浓度哈~你这个DNA浓度倒是也能做PCR
4楼2012-11-27 14:35:09
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素素2008

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-27 14:35:09
得看你RNA酶的浓度哈~你这个DNA浓度倒是也能做PCR

RNA酶的浓度为:10mg/ml。
5楼2012-11-27 15:56:27
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yongbo_liang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
浓度太低了,有污染或降解了。
6楼2012-11-27 16:05:11
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 素素2008 at 2012-11-27 15:56:27
RNA酶的浓度为:10mg/ml。...

这个浓度RNA酶也足够了啊~稀释个十倍五十倍做PCR试试吧~
8楼2012-11-27 18:44:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 欢迎交流经验 2012-11-28 13:42:25
RNase的量应该是可以的,可能是消化不很充分吧。不知道你是从多少藻里提出的这个样品。至于提的量少,最有可能的原因还是最初细胞破碎不完全。不知道你是用什么方法裂解细胞的。你如果只是要用这个DNA做PCR是可以的。你做的是真核藻还是原核藻?如果是原核的,加0.5-1ul模板就可以了,真核加2-5ul吧。

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

9楼2012-11-28 07:57:46
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素素2008

新虫 (初入文坛)

送鲜花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-28 07:57:46
RNase的量应该是可以的,可能是消化不很充分吧。不知道你是从多少藻里提出的这个样品。至于提的量少,最有可能的原因还是最初细胞破碎不完全。不知道你是用什么方法裂解细胞的。你如果只是要用这个DNA做PCR是可以的 ...

我做的是真核藻,我没有专门破碎细胞的步骤,只是加了些CTAB裂解液温育。老师说,这就算是破碎细胞的过程了。还说藻细胞很容易破裂的。请问虫友,你用的什么方法破碎的?我们是初做,一直在摸索,但效果很不好,不知道是不是破裂细胞这步出了问题。求教!我只是用它做PCR,但是一直做不出来了,成功率非常低,偶尔浓度达到50以上的,条带就很亮?求指教!
10楼2012-11-29 18:37:34
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