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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 提取DNA出现弥散------求助
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素素2008

新虫 (初入文坛)

[求助] 提取DNA出现弥散------求助

Sample TextSample Text求助：
     小虫做海洋藻类的DNA提取。虽然有条带，但是有很长的弥散拖带，求助：这是什么原因？因为DNA浓度很低，只有20ng/ml,所以模板量加的比较多。有4ul。用mix做的。引物为2ul。
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    • 2012-11-27 11:17:55, 162.77 K

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1楼 2012-11-27 11:21:19
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回帖置顶 ( 共有1个 )

rongduoyan

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2012-11-27 20:47:52
可能是PCR时，DNA模版浓度高了，也可能是提取DNA是不纯，建议点一个对照就知道了，即为mix换成水，与图中的样本一起跑PCR ，还有如果有扩出目的条带来了话，其实有弥散没关系的，如果怕不纯，可以回收后以其为模版重新第二次PCR 就可以了！
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7楼2012-11-27 16:05:55
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
样品里可能有RNA，弥散的是不完全降解的RNA吧。还有，20ng/ml好像是很低啊，确定不是20ng/ul吗？做PCR模板的话，10-50ng DNA就够了。
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素素2008
2楼2012-11-27 11:56:07
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素素2008

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-27 11:56:07
样品里可能有RNA，弥散的是不完全降解的RNA吧。还有，20ng/ml好像是很低啊，确定不是20ng/ul吗？做PCR模板的话，10-50ng DNA就够了。

哦哦。不好意思，是20ng/ul，不小心写错了。不过，提取时加入了RNA酶的。加了两ul。不知道是不是加的少了？
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3楼2012-11-27 13:13:13
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
得看你RNA酶的浓度哈~你这个DNA浓度倒是也能做PCR
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4楼2012-11-27 14:35:09
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素素2008

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by weigh1111 at 2012-11-27 14:35:09
得看你RNA酶的浓度哈~你这个DNA浓度倒是也能做PCR

RNA酶的浓度为：10mg/ml。
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5楼2012-11-27 15:56:27
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yongbo_liang

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
浓度太低了，有污染或降解了。
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6楼2012-11-27 16:05:11
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weigh1111

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 素素2008 at 2012-11-27 15:56:27
RNA酶的浓度为：10mg/ml。...

这个浓度RNA酶也足够了啊~稀释个十倍五十倍做PCR试试吧~
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8楼2012-11-27 18:44:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 欢迎交流经验 2012-11-28 13:42:25
RNase的量应该是可以的，可能是消化不很充分吧。不知道你是从多少藻里提出的这个样品。至于提的量少，最有可能的原因还是最初细胞破碎不完全。不知道你是用什么方法裂解细胞的。你如果只是要用这个DNA做PCR是可以的。你做的是真核藻还是原核藻？如果是原核的，加0.5-1ul模板就可以了，真核加2-5ul吧。
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素素2008
9楼2012-11-28 07:57:46
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素素2008

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-11-28 07:57:46
RNase的量应该是可以的，可能是消化不很充分吧。不知道你是从多少藻里提出的这个样品。至于提的量少，最有可能的原因还是最初细胞破碎不完全。不知道你是用什么方法裂解细胞的。你如果只是要用这个DNA做PCR是可以的 ...

我做的是真核藻，我没有专门破碎细胞的步骤，只是加了些CTAB裂解液温育。老师说，这就算是破碎细胞的过程了。还说藻细胞很容易破裂的。请问虫友，你用的什么方法破碎的？我们是初做，一直在摸索，但效果很不好，不知道是不是破裂细胞这步出了问题。求教！我只是用它做PCR,但是一直做不出来了，成功率非常低，偶尔浓度达到50以上的，条带就很亮？求指教！
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10楼2012-11-29 18:37:34
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