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请教一个western blot的问题，急需答案，谢谢！！！！ 已有20人参与
在做一个大小为32kDa的蛋白，是abcam的，按照计算的正常上样量，结果如图（已做完内参，没有问题）。怀疑是目的蛋白的表达量不够，增加上样量的结果如图。
实验的大致过程如下
1，电泳
60V(30min),80V（30min）,100V跑到底
2 转膜
半干转，15V（30min）,硝酸纤维素膜
3 封闭
37℃2h,3h,4℃过夜都试过,未发现太大影响（都做不出结果）。
4 一抗
4℃过夜或者37℃2h（根据封闭的时间选择），稀释度是按照说明书上的要求1：1000
5 洗膜
TBST 10min/次×6
6 二抗
37℃1h，稀释度1:5000
7 洗膜
同上
8 显影
ECL暗室处理3min（说明书要求，没问题），照相时的时间选择是5s,200s,50张。
抗体是用PBS稀释（实验室一直都是这么做的），试过用3%BSA稀释，无变化。
小弟已经实在想不出为什么了（快疯），请各位师兄师姐发发慈悲给小弟直条明路吧。
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正常上样量
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上样量加倍
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最大上样量 |
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