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相守以诺

铜虫 (初入文坛)

[求助] 质粒线性化跑胶拖带

各位虫友，我最近在做重组pPIC9K质粒转化毕赤酵母GS115，用Bpu1102 I 内切酶进行线性化切割，可每次切完以后跑胶都会出现严重拖带，在所要的目的条带（约为11000）处几乎看不到任何条带。之前试过20uL和50uL的体系，可都出现这个问题，酶切时间也有尝试分别用5、3h,可情况均类似。注：重组质粒所加的量约为体系40%，浓度约为0.5-1ug/uL.所附图片为50uL体系的电泳图，三个通道分别为10000DL的maker、酶切质粒、未酶切质粒。

质粒线性化跑胶拖带
酶切.jpg
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1楼 2015-01-11 16:50:32
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回帖置顶 ( 共有1个 )

eulota

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
相守以诺: 金币+5, 博学EPI+1, ★有帮助 2015-01-12 11:27:15
没有酶切的质粒跑的比较干净，酶切后的弥散条带很像是降解
所以，出现这种情况更大的可能性是酶切体系的不稳定：包括酶、缓冲液、水-----都需要排查
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2楼2015-01-11 17:32:02
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普通回帖

Look_2014

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
相守以诺: 金币+2, ★有帮助 2015-01-12 16:07:03
我们做酶切习惯4度过夜，不知道是不是条件问题，

[ 发自小木虫客户端 ]
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Look
3楼2015-01-11 18:06:19
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相守以诺

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by Look_2014 at 2015-01-11 18:06:19
我们做酶切习惯4度过夜，不知道是不是条件问题，

条件的话时间长了才更容易弥散呀？我也是第一次酶切遇到这种情况，之前用其他酶都挺好的。
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4楼2015-01-11 18:54:30
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相守以诺

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by eulota at 2015-01-11 17:32:02
没有酶切的质粒跑的比较干净，酶切后的弥散条带很像是降解
所以，出现这种情况更大的可能性是酶切体系的不稳定：包括酶、缓冲液、水-----都需要排查

非常感谢你的帮助。酶是从宝生物买的，污染的可能性较小，那就有可能是水喽？有没有可能是这个酶非特异性把其他序列给切割了呢？
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5楼2015-01-11 18:57:28
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eulota

金虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 相守以诺 at 2015-01-11 18:57:28
非常感谢你的帮助。酶是从宝生物买的，污染的可能性较小，那就有可能是水喽？有没有可能是这个酶非特异性把其他序列给切割了呢？...

酶的非特异性发生和酶所在的工作溶液是有关系的，建议现排除污染的可能性再下结论
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6楼2015-01-11 19:39:17
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