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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 全长的引物扩增为什么没有条带出现？
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楠楠1226

新虫 (小有名气)

[求助] 全长的引物扩增为什么没有条带出现？已有4人参与

各位大神：我需要的目的片段是3000bp（大豆）,用全长的引物扩增cDNA没有条带怎么回事呢？延伸时间是3min。应该对的呀。有知道的大神帮我分析下吧。J金币不多
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做好自己，加油
1楼2014-12-31 22:08:08
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
楠楠1226(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-01 22:33:03
先确定你的反转效率怎样，可以用一个常用的大片段扩一扩看看；再一个看看你的基因在你取样时期是否表达。你的引物跟cDNA结合怎样，增加些循环数。
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hehe
2楼2015-01-01 10:14:04
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YANJL

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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楠楠1226(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-01 22:33:47
有些序列可能不大好P吧，如果GC含量高的话可是试试加一点DMSO啊，也可以换个酶试一试，我之前P一段3k的，有的引物就P不出来，换了引物就很好P了，我后来用的GXL的酶，你可以试一下。
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3楼2015-01-01 15:43:26
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luyongchao

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是应该用LA Taq呢（长模板的Taq酶）
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4楼2015-01-01 20:35:35
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果全长扩增不出来，那你可以先设计对应全长序列一部分的引物，设计1-2套，扩增长度短一点的，看看能不能扩增出来，如果能，就说明模板cDNA没有问题，如果不能，就说明模板cDNA有问题。

如果模板cDNA没有问题，下一步就是改进你的扩增体系或者引物。主要有使用长片段聚合酶，引物重新设计；如果这样都不起作用就考虑别的方式了。
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5楼2015-01-02 07:41:37
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楠楠1226

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by soarrow at 2015-01-02 07:41:37
如果全长扩增不出来，那你可以先设计对应全长序列一部分的引物，设计1-2套，扩增长度短一点的，看看能不能扩增出来，如果能，就说明模板cDNA没有问题，如果不能，就说明模板cDNA有问题。

如果模板cDNA没有问题， ...

好的，谢谢方案。我试试
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做好自己，加油
6楼2015-01-03 09:49:14
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楠楠1226

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lvbobo823 at 2015-01-01 10:14:04
先确定你的反转效率怎样，可以用一个常用的大片段扩一扩看看；再一个看看你的基因在你取样时期是否表达。你的引物跟cDNA结合怎样，增加些循环数。

效率没问题的。谢谢提供建议啦，我再试试
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做好自己，加油
7楼2015-01-03 09:50:32
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楠楠1226

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by luyongchao at 2015-01-01 20:35:35
是不是应该用LA Taq呢（长模板的Taq酶）

用ex-tag没有扩出来
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做好自己，加油
8楼2015-01-05 09:35:52
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781055707

木虫 (著名写手)
你把扩增片段和引物发来看看，可能引物特异性不强。或做个巢式。
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楠楠1226
采菊东篱下，悠然见南山。
9楼2015-01-05 16:46:36
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楠楠1226

新虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by 781055707 at 2015-01-05 16:46:36
你把扩增片段和引物发来看看，可能引物特异性不强。或做个巢式。

用Primestar扩增出来了，谢谢啦
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做好自己，加油
10楼2015-01-06 14:21:41
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