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楠楠1226

新虫 (小有名气)

[求助] 全长的引物扩增为什么没有条带出现?已有4人参与

各位大神:我需要的目的片段是3000bp(大豆),用全长的引物扩增cDNA没有条带怎么回事呢?延伸时间是3min。应该对的呀。有知道的大神帮我分析下吧。J金币不多
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做好自己,加油
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

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如果全长扩增不出来,那你可以先设计对应全长序列一部分的引物,设计1-2套,扩增长度短一点的,看看能不能扩增出来,如果能,就说明模板cDNA没有问题,如果不能,就说明模板cDNA有问题。

如果模板cDNA没有问题,下一步就是改进你的扩增体系或者引物。主要有使用长片段聚合酶,引物重新设计;如果这样都不起作用就考虑别的方式了。
5楼2015-01-02 07:41:37
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lvbobo823

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


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楠楠1226(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-01 22:33:03
先确定你的反转效率怎样,可以用一个常用的大片段扩一扩看看;再一个看看你的基因在你取样时期是否表达。你的引物跟cDNA结合怎样,增加些循环数。
hehe
2楼2015-01-01 10:14:04
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YANJL

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


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楠楠1226(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-01 22:33:47
有些序列可能不大好P吧,如果GC含量高的话可是试试加一点DMSO啊,也可以换个酶试一试,我之前P一段3k的,有的引物就P不出来,换了引物就很好P了,我后来用的GXL的酶,你可以试一下。
3楼2015-01-01 15:43:26
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luyongchao

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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是不是应该用LA Taq呢(长模板的Taq酶)
4楼2015-01-01 20:35:35
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