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关于6%的尿素聚丙烯酰胺变性凝胶来跑RNA的一些问题
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由于是第一次做这个，所以都是一大堆的问题，希望大家多多发言，谢谢。 我要建RNA测序文库，要筛选50-500bp大小的RNA，但是考虑到要固定RNA的二级结构，所以，要用6%的尿素聚丙烯酰胺变性凝胶来跑，我用的marker是• Radiolabeled Decade and Century markers (Life Technologies)货号：am7778，这个marker，loading buffer是marker中带的，现在问题如下： 1.这个凝胶的配方是什么，是我们平时的蛋白胶的配方吗？就是水，30%丙烯酰胺，tris，sds，过硫酸铵，temed？是只有分离胶，没有浓缩胶哈？ 2.电泳缓冲液的配方是什么，是我们平时跑蛋白的时候，用的tbe（tris，甘氨酸，edta）吗？还是有什么新的配方。 3.试验中需要注意些什么？比如说，电泳的时候，电泳buffer中需要加些什么东西吗？比如甲酰胺或者尿素，还有听说在上样的时候要吹上样孔？就是用电泳buffer反复清洗上样孔吗？ 4.试验中都要保证是RNase free环境吗?怎么保证？ 5.染胶用eb就可以嘛？切胶再在外线切胶台就ok？拍照的话，就是在紫外曝光仪中就可以嘛？ 6.上样的时候loading buffer中还要加其他东西吗？像甲酰胺或者尿素之类的。 7.还有就是甲酰胺或者尿素这个东西在这个实验中要用到嘛？在哪一步用到？ 问题就这么多？请大家踊跃发言，多谢多谢！ |
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