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化学521

新虫 (正式写手)

[求助] SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳成像结果的若干问题

我做了一个蛋白质SDS聚丙酰胺凝胶电泳，但是结果很丑，想请各位帮忙分析一下。第二道是我用2M硫酸铵盐析蛋白质沉淀以后的上清液5ul，第三道是上一步的蛋白质沉淀用1M硫酸铵溶解后的上清液5ul，第四道是1M硫酸铵未能溶解的沉淀加了等量水溶解5ul；第五道样品同第二道但上样量10ul，第六道同第三道10ul，第七道同第四道10ul；
（1）第五道变胖是因为第四道蛋白浓度太低了吗
（2）第六道弯曲是因为盐度太高了吗还是被第五道更高盐度影响了
（3）题外话：beta-巯基乙醇，尿素，盐酸胍三者分别作变性剂的区别在哪里，对电泳结果成像有何影响
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳成像结果的若干问题
2013-07-13 15hr 37min.jpg
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1楼 2013-07-13 23:54:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励应助！ 2013-07-14 02:42:05
你的样品中含有大量的盐，离子强度太高，这些都会影响SDS-PAGE的效果。泳道变宽或者变窄是因为样品之间的渗透压力不同，对旁边的泳道造成的压迫不一样。
巯基乙醇是还原剂，用于打开二硫键。尿素和盐酸胍都是变性剂，可以打开蛋白的氢键，破坏蛋白质的高级结构，同时可以增加疏水蛋白在水溶液中的溶解性。盐酸胍具有离子性，往往比尿素有更强的变性效果。
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2楼2013-07-14 00:17:27
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alicelchf

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
marker都跑得。。。这样问题很多了：
buffer？电压？
上样量目测没有多大问题，但是变性剂成分含量会有影响的如2楼所述！
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修身、齐家、治国、平天下
3楼2013-07-14 10:53:50
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肃清华书

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
胶可能做的有点问题吧……还有样品盐浓度高了，2L说的很好，第四道是怎么回事，好像很淡的样子。。
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4楼2013-07-14 11:26:24
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化学521

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-14 00:17:27
你的样品中含有大量的盐，离子强度太高，这些都会影响SDS-PAGE的效果。泳道变宽或者变窄是因为样品之间的渗透压力不同，对旁边的泳道造成的压迫不一样。
巯基乙醇是还原剂，用于打开二硫键。尿素和盐酸胍都是变性剂 ...

如果用盐酸胍作为变性剂的话，会不会由于离子的电导率很高，导致胶跑的很丑？？？
同时可以增加疏水蛋白在水溶液中的溶解性。这个有什么影响吗？
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5楼2013-07-15 13:51:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 化学521 at 2013-07-15 13:51:10
如果用盐酸胍作为变性剂的话，会不会由于离子的电导率很高，导致胶跑的很丑？？？
同时可以增加疏水蛋白在水溶液中的溶解性。这个有什么影响吗？...

一般蛋白样品想跑出好的效果最好能除去过多的盐分。你的样品是硫酸铵沉淀的组分，盐浓度本身就比较高，盐酸胍的确有可能影响胶。如果样品的浓度比较高，上样后盐的浓度其实已经降低不少了，胶应该不是很难看。盐酸胍和尿素的变性很大程度上是可逆的，增强疏水蛋白的水溶性对蛋白变性复性是有好处的。
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6楼2013-07-16 01:02:29
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lim1896

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

制备分离胶和浓缩胶时，试剂一定要混匀，尤其是在加完TEMED之后，如果量少不好摇晃，可以用枪搅，就像打鸡蛋那样，多混一下，胶的效果会好一些，不然，容易跑成“山水画”
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7楼2013-07-17 10:55:14
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