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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SDS聚丙烯酰胺蛋白电泳 上样时蛋白样品从孔中飘出
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baier_1989

新虫 (初入文坛)

[求助] SDS聚丙烯酰胺蛋白电泳 上样时蛋白样品从孔中飘出

我做的是肝脏提取的线粒体蛋白，和2X loading buffer混合煮沸，一上到孔中样品，就开始从孔里呈线状向上飘，一会就全浮到缓冲液里了，电泳后什么也跑不出来。奇怪的是我用的低标蛋白marker也飘出来了，（marker我也和2X loading buffer混合了，但没有煮沸）以前做过，没出现这情况。以前做的时候2X loading buffer是别人配好的的，这次是我新配的，蛋白样品是1月提取的，跑过一次胶后，就一直-70存着。
       是2X loading buffer的问题，还是蛋白已经降解了？有几个样品没有飘出，但是跑出来整个道都是，一个柱状，没有条带。胶应该没问题。
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1楼 2012-04-17 22:15:22
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回帖置顶 ( 共有3个 )

dovekaoyan

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
baier_1989: 回帖置顶 2012-06-04 19:09:11
胶孔没洗干净，我前两次也出现过这种现象，就是因为胶孔里面有碎胶，解决办法：插梳子、拔梳子时候要干脆利索，这样产生的碎胶少，洗胶孔时候用稍大一些的（如20ml容量）注射器洗涤，尽量使对胶孔的冲击力大一些，把碎胶都冲出来，再上样就好多了。
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14楼2012-04-19 09:31:50
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东方龙飞

铜虫 (正式写手)
baier_1989: 回帖置顶 2012-06-04 19:09:17
分析下来，三个原因：
1、 你的样品孔做浓缩胶的时候有问题，所以导致样品进不去，一点样就漂，或者根本就压不下去。
2、 你的样品处理的有问题，也就是说loading buffer稀释倍数太多了，所以样品会漂。
3、 你的样品有问题，蛋白不够。因为即使是水+loading buffer，也还是会沉到底的。
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19楼2012-04-19 16:56:53
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小梦花花

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜: 金币+1, 鼓励交流~ 2012-05-09 19:04:52
baier_1989: 回帖置顶 2012-06-04 19:08:45
是梳子与胶玻璃板的制备的胶厚度不配套么？我遇到过配套导致的进样孔上油碎胶，换了配套的梳子就没事了。
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24楼2012-05-09 14:08:39
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mungbean3881

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
baier_1989: 金币+1, ★★★很有帮助, 是胶孔的问题 2012-06-04 19:06:48
是不是梳子孔里的游离胶没吹干净啊
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吃亏未必是祸，占便宜一定不是福
4楼2012-04-18 08:20:22
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baier_1989

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by mungbean3881 at 2012-04-18 08:20:22:
是不是梳子孔里的游离胶没吹干净啊

有可能 请问您是怎么吹游离胶的 我原来用针挑过 效果不是很好
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7楼2012-04-18 14:31:17
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open3377

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
缓冲液问题吧，换下电泳缓冲液看看
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2楼2012-04-17 23:36:13
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lzgxgz

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
样品缓冲液不是忘加甘油了吧
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3楼2012-04-18 05:26:10
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baier_1989

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by open3377 at 2012-04-17 23:36:13:
缓冲液问题吧，换下电泳缓冲液看看

缓冲也是新配置的 5X甘氨酸缓冲液 应该没有问题吧
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5楼2012-04-18 14:29:10
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baier_1989

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lzgxgz at 2012-04-18 05:26:10:
样品缓冲液不是忘加甘油了吧

甘油加了
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6楼2012-04-18 14:30:01
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YZQ_XM

铜虫 (初入文坛)
应该是孔的问题吧
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8楼2012-04-18 15:03:14
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励应助！ 2012-04-18 18:18:29
这情况还真没出现过，再确定下是否加甘油了？
另外是否是开始电泳了才往出漂，如果是，检查下是否是电极接反了。
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Thank-you，so-blue.
9楼2012-04-18 16:14:28
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michellefree

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-04-19 13:45:04
以前也有一次这种情况，是把正负极接反了，这种情况下如果样品还在孔里面没有逸到缓冲液里的话，还可以换过电极接着跑。不过你这种一上样就往上飘，应该是因为样品的比重太小了，要么是你的样品缓冲液比重小，要么是你的跑胶缓冲液有问题，成分比例有问题吧。一般情况下只上样蛋白质Marker不会出现这种问题（蛋白质Marker一般很快就能落下并且在孔的底部不上飘），你加了样品缓冲液却飘了，最大的可能就是样品缓冲液有问题。建议重新配。
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10楼2012-04-18 20:09:55
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