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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » qrt-pcr加cDNA的量，怎么加？
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sadhappy

新虫 (正式写手)

[交流] qrt-pcr加cDNA的量，怎么加？已有6人参与

说明书如下，cDNA要加100ng，那么体积怎么算？
如果反转录加的RNA总量是1μg,20μl体系。最后反转录的CDNA有多少？
我看有的人说就加1μl,好像是稀释后加的，那么稀释的标准是什么啊？如何稀释


 \"qrt-pcr加cDNA的量，怎么加？\"
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1楼2014-10-18 08:18:20
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needle_ld

至尊木虫 (正式写手)

木虫学者
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-10-20 08:47:08
我不知道你用什么反转录体系。我看不到你的说明书。
我的理解是，反转录并不扩增。所以，通常我都是准备2000ng的RNA做反转录。RT之后，cDNA就当是2000ng。20ul的体系，1ul就是100ng。
楼上朋友们说反转录之后测cDNA浓度，似不妥。因为反转录体系里成分已经很复杂，有dNTP，酶，缓冲液，模板，RNA酶抑制剂，随机引物。这么复杂的成分，会影响浓度的测量。
至于最后用多少cDNA做PCR，这个要看你的实验目的是什么，目标基因的丰度，使用何种设备，何种PCR体系，等等。
我做过组织和细胞样品的mRNA水平检测，用Applied Biosystems 9600， Sybr Green。大部分的样品cDNA（如上制备）需要稀释100倍做qPCR，供你参考。
如果你以前没做过qRT－PCR（看起来是这样哈：），估计需要摸索一段时间才可能得到比较可信的数据。这个东西，说简单就简单，照说明书做，不很复杂；但要想做得好，得到可信、稳定的数据，有很多细节。真正做好还是要花点功夫的。祝你好运。
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平等观诸法，悲心救世间。解彼真实性，得佛智慧光。
4楼2014-10-18 14:14:06
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needle_ld

至尊木虫 (正式写手)

木虫学者
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-10-24 20:33:49
引用回帖:
7楼: Originally posted by sadhappy at 2014-10-19 19:46:55
首先十分感谢您的帮助。
按照您说的2000ng反转录，20UL体系，只是转录，无扩增，
最后上样稀释100倍，换算也就是1ng/ul，总量是1ng.
请问您这个样本量跑出来结果还可以吧？
我的说明书上要求100ng-100fg之间， ...

小鼠卵巢，我没做过。
我用这个体系，做过小鼠肝、脂肪、肌肉组织；肝细胞、脂肪细胞。都没问题。
小鼠卵巢有多重？几毫克总有吧。组织类型接近脂肪，我们都是用铁砂打碎组织的。实在不放心，先用Qiagen的柱子提提。qRT-PCR的样品量要求很少的。你要试试做。最后溶解RNA时少用点水，保证浓度。
新鲜组织放在－80度冰箱，几个月一般不会有太大问题。当然越快做越好。
一般来说，样品很少的情况针对细胞实验。动物组织标本，通常都够大的。基本不用顾虑量的问题。
如果实验动物标本比较贵重，你可以先用正常小鼠卵巢试试。用内参基因引物把方法条件摸清楚，再处理正式实验样品。祝你顺利！
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平等观诸法，悲心救世间。解彼真实性，得佛智慧光。
9楼2014-10-20 12:21:14
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593318518

新虫 (小有名气)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-24 20:33:59
你首先测你得到的CDNA量，然后稀释成100ng/ul 或者其他浓度就好了啊。具体浓度看你经后使用的梯度
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2楼2014-10-18 10:38:26
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刘芬玲

金虫 (初入文坛)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-24 20:34:18
反转录后先去测cDNA的浓度啊，然后再稀释的浓度计算加样量就好了
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3楼2014-10-18 11:43:56
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sadhappy

新虫 (正式写手)
这次 图能看到吗？？
qrt-pcr加cDNA的量，怎么加？-1
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5楼2014-10-20 08:26:22
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sadhappy

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 593318518 at 2014-10-18 10:38:26
你首先测你得到的CDNA量，然后稀释成100ng/ul 或者其他浓度就好了啊。具体浓度看你经后使用的梯度

是不是测260   280？？这不是测RNA浓度的吗？
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6楼2014-10-20 08:28:37
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sadhappy

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by needle_ld at 2014-10-18 14:14:06
我不知道你用什么反转录体系。我看不到你的说明书。
我的理解是，反转录并不扩增。所以，通常我都是准备2000ng的RNA做反转录。RT之后，cDNA就当是2000ng。20ul的体系，1ul就是100ng。
楼上朋友们说反转录之后测cD ...

首先十分感谢您的帮助。
按照您说的2000ng反转录，20UL体系，只是转录，无扩增，
最后上样稀释100倍，换算也就是1ng/ul，总量是1ng.
请问您这个样本量跑出来结果还可以吧？
我的说明书上要求100ng-100fg之间，相差这么大，
真不知道该如何选择？

还有一个问题请教，我要提取小鼠卵巢的RNA，
这个量比较少，
RNA提出多少才能做后面的步骤,?有标准码？

最后一个小问题，提出的组织放冻存管里了，
但是冻存管是国产的，大袋装的，我没有高压
不知道会不会降解？
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7楼2014-10-20 08:46:55
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sadhappy

新虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by needle_ld at 2014-10-18 14:14:06
我不知道你用什么反转录体系。我看不到你的说明书。
我的理解是，反转录并不扩增。所以，通常我都是准备2000ng的RNA做反转录。RT之后，cDNA就当是2000ng。20ul的体系，1ul就是100ng。
楼上朋友们说反转录之后测cD ...

再问一个问题，
RNA比较少的情况下，
相对定量 上样的cDNA总量 最少是多少？
说明说上是100fg,
因为样品比较宝贵，所以问的比较多，见谅额
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8楼2014-10-20 08:58:12
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sadhappy

新虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by needle_ld at 2014-10-20 12:21:14
小鼠卵巢，我没做过。
我用这个体系，做过小鼠肝、脂肪、肌肉组织；肝细胞、脂肪细胞。都没问题。
小鼠卵巢有多重？几毫克总有吧。组织类型接近脂肪，我们都是用铁砂打碎组织的。实在不放心，先用Qiagen的柱子提 ...

感谢你，做了预实验 来汇报下
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10楼2014-10-20 20:17:13
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