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sadhappy新虫 (正式写手)
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qrt-pcr加cDNA的量，怎么加？ 已有6人参与
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说明书如下，cDNA要加100ng，那么体积怎么算？ 如果反转录加的RNA总量是1μg,20μl体系。最后反转录的CDNA有多少？ 我看有的人说就加1μl,好像是稀释后加的，那么稀释的标准是什么啊？如何稀释 ![\"qrt-pcr加cDNA的量，怎么加？\"](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2014/1018/w316h722882_1413591408_842.jpg#opennewwindow\") |
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-10-20 08:47:08
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我不知道你用什么反转录体系。我看不到你的说明书。 我的理解是，反转录并不扩增。所以，通常我都是准备2000ng的RNA做反转录。RT之后，cDNA就当是2000ng。20ul的体系，1ul就是100ng。 楼上朋友们说反转录之后测cDNA浓度，似不妥。因为反转录体系里成分已经很复杂，有dNTP，酶，缓冲液，模板，RNA酶抑制剂，随机引物。这么复杂的成分，会影响浓度的测量。 至于最后用多少cDNA做PCR，这个要看你的实验目的是什么，目标基因的丰度，使用何种设备，何种PCR体系，等等。 我做过组织和细胞样品的mRNA水平检测，用Applied Biosystems 9600， Sybr Green。大部分的样品cDNA（如上制备）需要稀释100倍做qPCR，供你参考。 如果你以前没做过qRT－PCR（看起来是这样哈：），估计需要摸索一段时间才可能得到比较可信的数据。这个东西，说简单就简单，照说明书做，不很复杂；但要想做得好，得到可信、稳定的数据，有很多细节。真正做好还是要花点功夫的。祝你好运。 |
4楼2014-10-18 14:14:06
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-10-24 20:33:49
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-10-24 20:33:49
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小鼠卵巢，我没做过。 我用这个体系，做过小鼠肝、脂肪、肌肉组织；肝细胞、脂肪细胞。都没问题。 小鼠卵巢有多重？几毫克总有吧。组织类型接近脂肪，我们都是用铁砂打碎组织的。实在不放心，先用Qiagen的柱子提提。qRT-PCR的样品量要求很少的。你要试试做。最后溶解RNA时少用点水，保证浓度。 新鲜组织放在－80度冰箱，几个月一般不会有太大问题。当然越快做越好。 一般来说，样品很少的情况针对细胞实验。动物组织标本，通常都够大的。基本不用顾虑量的问题。 如果实验动物标本比较贵重，你可以先用正常小鼠卵巢试试。用内参基因引物把方法条件摸清楚，再处理正式实验样品。祝你顺利！ |
9楼2014-10-20 12:21:14
2楼2014-10-18 10:38:26
刘芬玲
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3楼2014-10-18 11:43:56
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