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sadhappy

新虫 (正式写手)

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[交流] qrt-pcr加cDNA的量，怎么加？已有6人参与

说明书如下，cDNA要加100ng，那么体积怎么算？
如果反转录加的RNA总量是1μg,20μl体系。最后反转录的CDNA有多少？
我看有的人说就加1μl,好像是稀释后加的，那么稀释的标准是什么啊？如何稀释

$\"qrt-pcr加cDNA的量，怎么加？\"$

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1楼2014-10-18 08:18:20

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needle_ld

至尊木虫 (正式写手)

木虫学者

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-10-20 08:47:08

我不知道你用什么反转录体系。我看不到你的说明书。
我的理解是，反转录并不扩增。所以，通常我都是准备2000ng的RNA做反转录。RT之后，cDNA就当是2000ng。20ul的体系，1ul就是100ng。
楼上朋友们说反转录之后测cDNA浓度，似不妥。因为反转录体系里成分已经很复杂，有dNTP，酶，缓冲液，模板，RNA酶抑制剂，随机引物。这么复杂的成分，会影响浓度的测量。
至于最后用多少cDNA做PCR，这个要看你的实验目的是什么，目标基因的丰度，使用何种设备，何种PCR体系，等等。
我做过组织和细胞样品的mRNA水平检测，用Applied Biosystems 9600， Sybr Green。大部分的样品cDNA（如上制备）需要稀释100倍做qPCR，供你参考。
如果你以前没做过qRT－PCR（看起来是这样哈：），估计需要摸索一段时间才可能得到比较可信的数据。这个东西，说简单就简单，照说明书做，不很复杂；但要想做得好，得到可信、稳定的数据，有很多细节。真正做好还是要花点功夫的。祝你好运。