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sadhappy

新虫 (正式写手)

[交流] qrt-pcr加cDNA的量，怎么加？ 已有6人参与

说明书如下，cDNA要加100ng，那么体积怎么算？
如果反转录加的RNA总量是1μg,20μl体系。最后反转录的CDNA有多少？
我看有的人说就加1μl,好像是稀释后加的，那么稀释的标准是什么啊？如何稀释


 \"qrt-pcr加cDNA的量，怎么加？\"
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1楼 2014-10-18 08:18:20
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刘芬玲

金虫 (初入文坛)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-24 20:34:18
反转录后先去测cDNA的浓度啊，然后再稀释的浓度计算加样量就好了
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3楼2014-10-18 11:43:56
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593318518

新虫 (小有名气)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-10-24 20:33:59
你首先测你得到的CDNA量，然后稀释成100ng/ul 或者其他浓度就好了啊。具体浓度看你经后使用的梯度
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2楼2014-10-18 10:38:26
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needle_ld

至尊木虫 (正式写手)

木虫学者
★ ★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2014-10-20 08:47:08
我不知道你用什么反转录体系。我看不到你的说明书。
我的理解是，反转录并不扩增。所以，通常我都是准备2000ng的RNA做反转录。RT之后，cDNA就当是2000ng。20ul的体系，1ul就是100ng。
楼上朋友们说反转录之后测cDNA浓度，似不妥。因为反转录体系里成分已经很复杂，有dNTP，酶，缓冲液，模板，RNA酶抑制剂，随机引物。这么复杂的成分，会影响浓度的测量。
至于最后用多少cDNA做PCR，这个要看你的实验目的是什么，目标基因的丰度，使用何种设备，何种PCR体系，等等。
我做过组织和细胞样品的mRNA水平检测，用Applied Biosystems 9600， Sybr Green。大部分的样品cDNA（如上制备）需要稀释100倍做qPCR，供你参考。
如果你以前没做过qRT－PCR（看起来是这样哈：），估计需要摸索一段时间才可能得到比较可信的数据。这个东西，说简单就简单，照说明书做，不很复杂；但要想做得好，得到可信、稳定的数据，有很多细节。真正做好还是要花点功夫的。祝你好运。
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平等观诸法，悲心救世间。解彼真实性，得佛智慧光。
4楼2014-10-18 14:14:06
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sadhappy

新虫 (正式写手)
这次 图能看到吗？？
qrt-pcr加cDNA的量，怎么加？-1
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5楼2014-10-20 08:26:22
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