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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于目的基因导入pet-28a中是否会发生移码问题!
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well_想太多

新虫 (小有名气)

[求助] 关于目的基因导入pet-28a中是否会发生移码问题! 已有4人参与

本人想用pet-28a作为表达载体,引物 已经设计完了,才意识到移码的问题.想问问怎么看我的目的基因导入进28a后是否会发生移码呢?我选的酶切问点分别是BamHI和HindIII, 需要看目的基因序列吗?还是看引物?我在我的酶切位点前面加了2-3个保护碱基:CG GGATCC CG   BamHI
             CCC AAGCTT GGG   HindIII
引物分别是:5`>CG GGATCC CG ATGTCTCTTCGACGTATTCTC<3`
                   5`>CCC AAGCTT GGGTCAGCAGTACAGGTTGCC<3`
如果发生移码了,是不是需要从新设计引物P目的基因序列?
下面是CDS序列,新手,勿怪!

ATGTCTCTTC GACGTATTCT CGCGGCGGTCGCCGCCACCTTCGCCGCCACCACGGTCGCCGTGGTCGTCC
CGACGCAGTCCGCCTCCGCCGCGGACTGCGTGGCGCCGTGGAACGCGAGTTCGGTCTACTGGGGCGGCAA
CACCGCGTCCTACAACGGGCACAACTGGTCCGCGAAGTGGTGGACGCAGAACGAAACCCCAGGTGCAGCG
CAGGTCTGGGCCGATCAGGGCGCCTGCGGCGGCGGGACGACCAACCCGCCGAACCCGTCCGGCTTCGTGG
ACAGTTCAACCAGATGTTCCCGAGCCGGAATCCCTTCTACACCTACAACGGCCTGGTCAC
CGCGCTCAGCGCCTACCCGGCCTTCGCGGGCACGGGCAGCGACACCGTGAAGAAGCAGGAAGCGGCGGCC
TTCCTGGCGAACGTCAGCCACGAGACCGGCGGACTGGTCCACATCGTCGAGCAGAACGAAGCGAACTACC
CGCACTACTGCGACACGAGCCAGTCCTACGGCTGCCCCGCCGGCAACGCCGCGTACTACGGCCGCGGCCC
GATCCAGCTCAGCTGGAACTTCAACTACAAGGCCGCCGGCGACGCGCTCGGCCTGCCACTGCTGACCAAC
CCGTGGCTGGTGCAGAACGACGCGGCGGTCGCCTGGAAGACCGGCATCTGGTACTGGATGACCCAGAACG
GTCCCGGCACGATGACCCCGCACAACGCGATGGTCAACAGCCGCGGCTTCGGCGAGACGATCCGCAGCAT
CAACGGGAGCATCGAGTGCAACGGCGGCAACCCCGCCCAGGTGCAGAGCCGCGTGAACAAGTACCAGCAG
TTCACCGGCATCCTCGGCGTCACCCCCGGCGGCAACCTGTACTGCTGA
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1楼 2014-09-22 20:58:14
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

bolysu

禁虫 (著名写手)
★
感谢参与，应助指数 +1
well_想太多: 金币+1, ★有帮助 2014-09-23 13:42:38
本帖内容被屏蔽
2楼2014-09-23 09:21:18
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393658000

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2014-09-24 17:46:41
不懂为何你要在BamHI中间塞入碱基，因为你既然选择了BamHI作为第一个酶，那么你就默认了需要用到载体本身上的5‘His,这样的话你的第一条引物塞入了2个碱基，所以后面ORF肯定移码，你要么不塞，要么塞3的倍数，但是个人建议不要塞
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9楼2014-09-24 09:20:23
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普通回帖

whh2013

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
重新扩吧，和我一样的问题，
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3楼2014-09-23 11:03:21
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whh2013

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你不是从ATG扩的吗？这样没有没有问题啊
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4楼2014-09-23 11:05:49
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well_想太多

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by whh2013 at 2014-09-23 11:03:21
重新扩吧，和我一样的问题，

恩,从新设计了一条引物
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5楼2014-09-23 13:39:01
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well_想太多

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bolysu at 2014-09-23 09:21:18
移不移码，是从载体上看的，载体上开始翻译的ATG，三个三个数，看是否正好到你的ATG正好是3的整数倍。

上面那条引物应该是会移码,我又加了一个保护碱基.5`>CGc GGATCC CGc ATGTCTCTTCGACGTATTCTC<3`,这样应该就不会了吧
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6楼2014-09-23 13:40:36
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well_想太多

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by whh2013 at 2014-09-23 11:05:49
你不是从ATG扩的吗？这样没有没有问题啊

但是转进pet-28a就会移码啊
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7楼2014-09-23 13:43:28
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caihang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
well_想太多(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-23 19:52:23
没有仔细看你的片段，但是问一句：你的片段自带终止子，还是用载体上的？如果自带酒没问题，如果用载体上的，依然要考虑片尾移码的问题。
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8楼2014-09-23 15:30:45
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ccandcc

木虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 393658000 at 2014-09-24 09:20:23
不懂为何你要在BamHI中间塞入碱基，因为你既然选择了BamHI作为第一个酶，那么你就默认了需要用到载体本身上的5‘His,这样的话你的第一条引物塞入了2个碱基，所以后面ORF肯定移码，你要么不塞，要么塞3的倍数，但是个 ...

我也建议不要塞
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10楼2014-09-24 16:29:39
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