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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 2600bp基因扩增
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hajierlove

铜虫 (正式写手)

[求助] 2600bp基因扩增 已有6人参与

2600bp基因扩增，用green mix,pcr体系，模板，引物各1u，水，9.5，mix12.5.反应程序，95度2min，95度30s，55度30s，72度3min，38个循环，72度5min。10保持。
大神们帮忙看看有什么问题，有没有好用一点的酶推荐
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踏实
1楼 2014-09-18 22:37:33
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

sunnyheart12

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

2.6KB，建议增加以下模板的用量：微生物模板要大于10ng，人要大于100ng。也可以尝试在反应体系中加入甘油、提高Mg离子浓度。也可以考虑换酶（个人建议使用Vazyme的Phanta或者Taq Plus）或者换引物。希望对你能有帮助！
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11楼2014-10-05 05:16:12
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普通回帖

hajierlove

铜虫 (正式写手)
试了很多次p不出来，其他700bp的都做到蛋白表达了，亲们，help
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踏实
2楼2014-09-18 22:38:18
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
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hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-19 16:29:16
知道序列直接去合成吧。
可以分段扩增，有个重叠就好

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2014-09-18 22:47:39
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kuenyunliu

铜虫 (初入文坛)
用Q5 或者phusion试试
你只问了要什么酶推荐 以上
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4楼2014-09-18 23:25:05
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我欲乘风归去

木虫 (正式写手)
★
hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-19 16:29:27
你的片段是不是高GC含量的，试一试高GCbuffer的扩增酶。
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。
5楼2014-09-19 10:30:33
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非常6+1

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
hajierlove(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-19 16:29:37
你可以做个温度梯度试试，有可能退火温度不对，特异性差。再者，更换DNA聚合酶，严格按照说明书设定PCR程序。都不行，检查你的引物是不是设计错误。5'和3’端是不是弄反了，我倾向于你引物设计错误。
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6楼2014-09-19 11:32:16
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小小c的123

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-05 12:52:45
有些问题大家回复过，我就结合我的经历提醒一下。首先，模板的浓度，这个有时候会忽略，我一般用50ng/ul的浓度；还有就是果断换一支酶试试，我之前遇到过酶污染了，一直p不出...都不行的话，可以真的要从引物入手了...
看了你的程序有两个疑问：你的预变性时间才2min，会不会有点短了；循环次数是38次，会不会加大你的错配概率...
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7楼2014-09-21 11:18:45
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a50044758

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-05 12:52:56
phanta，比phusion强，里面最好加PCR enhancer。你是从基因组里面P吗？你检查下你的引物，退火温度设计的有没问题吧。
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8楼2014-09-22 10:19:54
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woyaoniqusi

新虫 (初入文坛)
KOD FX
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9楼2014-09-24 10:45:30
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乔斌

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-10-05 12:53:10
换个酶试试吧，是不是你的GC含量太高啊，Pnanta Max和KOD Fx 都不错，Max保真度更高些，要是还P不出来那就看看引物等其他原因。

[ 发自小木虫客户端 ]
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10楼2014-09-24 12:51:44
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