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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于T4和solution I 的连接问题
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寒心季

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于T4和solution I 的连接问题 已有3人参与

酶切液用T4的连接效果不是很好，后来有人告知可以用T载体中的solution I 连接。
原体系是这样的： 酶切液                10ul
                             R-Adaptor            2ul
                            10XLigase buffer    2 ul
                            T4 DNA Ligase       2ul
                            水                          4ul
                    总共是20ul。
现在换成solution I 连接，请问体系该怎么样变？就 酶切液、R-Adaptor  、水、solution I 四样构成一个新体系，还需要其他吗？
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1楼 2014-09-17 22:06:37
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-09-18 18:29:49
酶切后要胶回收，不能直接用酶切液体做连接！T连接很容易，你上面的体系的有问题，一般连接前最好计算下载体与片断的摩尔比，一般1：3-1：10之间都非常好连接！solution I 里面包括Ligase buffer  和 T4 DNA Ligase ，用量是2倍的！10UL体系就用5UL的 solution I ！个人认为楼主不是酶的问题，主要还是楼主体系没有计算和酶切产物没有胶回收！
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3楼2014-09-18 08:37:19
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lijianfu12

银虫 (正式写手)
就按照说明书

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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好好搞学术
2楼2014-09-18 00:20:29
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凤丫头1988

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
弱弱问一句，  R-Adaptor 是什么啊
赞一下 回复此楼
最小的事情也要尽力
4楼2014-09-18 08:44:18
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寒心季

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by huyan0817 at 2014-09-18 08:37:19
酶切后要胶回收，不能直接用酶切液体做连接！T连接很容易，你上面的体系的有问题，一般连接前最好计算下载体与片断的摩尔比，一般1：3-1：10之间都非常好连接！solution I 里面包括Ligase buffer  和 T4 DNA Ligase ...

感谢回复！我是按照实验室的博士论文指导来做的。它这里的酶切液酶切的是双链cDNA，酶切后并未要求胶回收，体系也是按照指导来的，应该不会有太大问题。
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5楼2014-09-18 10:14:29
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