| 查看: 6674 | 回复: 5 | ||
[求助]
一端为黏性末端一端为平末端的连接方法 已有3人参与
|
|
现在在做克隆，一端为PstI，一端为SmaI（平端），克隆后连接了全式金的T3载体，现在双酶切片段和载体后连接不上，哪位提供点好的建议，谢谢！ 我用的T4连接酶是NEB的，体系10微升，4度连接过夜转化后也不长。 |
回复此楼» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有239人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 粘性末端连接时长问题
已经有27人回复
- 单酶切后的载体和目的片段是否都需要去磷酸化
已经有4人回复
- 合成的引物直接退火形成粘性末端后连入载体
已经有13人回复
- BamHI,SmaI平末端粘性末端连接问题
已经有11人回复
- 平末端加A尾连接T载体的问题
已经有14人回复
- 关于使载体平末端环化的问题
已经有14人回复
- 平末端连接不上，求助
已经有21人回复
- 关于平末端连接
已经有14人回复
- 将含精氨酸，赖氨酸的多肽用EDC反应连接到PLA的末端羧基上
已经有5人回复
- 一个平末端和粘性末端怎样连接比较好
已经有8人回复
- 求助：一端为黏性末端一端为平末端的克隆
已经有9人回复
- 双酶切粘性末端连接不上
已经有21人回复
- 平末端连接做不出来克隆
已经有30人回复
- 大片段连接问题
已经有20人回复
- 基因工程课程小结
已经有20人回复
- 虚心请教关于平—粘末端的连接问题
已经有18人回复
- DNA片段经过酶切后的粘性末端怎么磨平？
已经有15人回复
- 【求助/交流】酶切后的粘性末端补平
已经有4人回复
- 谁做过pEASY-Blunt Cloning啊？谁做过平末端连接啊？
已经有7人回复
- 【求助/交流】粘性末端连接问题
已经有12人回复
★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-11 16:52:49
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-11 16:52:49
|
本帖内容被屏蔽 |
2楼2014-07-11 12:23:37
3楼2014-07-14 09:51:15
4楼2014-07-14 10:23:08
chenyhok1987
银虫 (正式写手)
- 应助: 11 (小学生)
- 金币: 3101.2
- 散金: 814
- 红花: 6
- 帖子: 633
- 在线: 569.6小时
- 虫号: 1418854
- 注册: 2011-09-27
- 性别: GG
- 专业: 污染控制化学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★
zb0806030(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-07-14 18:20:30
zb0806030(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-07-14 18:20:30
| 本人两个重组质粒都是一端平端一端粘度重组成功的，不过其中一共花费了两个月的时间，有些小长，总体来说这种连接方法还是蛮有难度的，一端连接效率快一端连接慢，连接反应效率处于不平衡的状态，难度大于双平端连接大于双黏端，有时候还需要一些运气的，其中载体和目的基因双酶切我是采用NEB的HF版本，试剂盒采用天根回收试剂盒，最好一步使用纯水洗脱，不推荐使用TE缓冲液，水是最好的溶剂，然后回收后目的基因和载体浓度都要加大一些浓度，你可以试试变换几个浓度连接，然后我使用大连宝生物的Solution1连接酶连接的，也是16度过夜的，最好前后做了两个重组质粒接近两个月吧出来的，时间比双黏端要久一些，楼主要有耐心，按照我的方法相信你一定可以做出来的！祝您好运~~~另外你的这个T4连接酶不适于这个连接，T4现在还是更适应于双黏端的连接！ |
5楼2014-07-14 13:44:01
moshangchenx
金虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 1913.7
- 散金: 7
- 红花: 1
- 帖子: 345
- 在线: 69.2小时
- 虫号: 1573517
- 注册: 2012-01-11
- 专业: 认知科学
6楼2015-01-12 16:43:32
40