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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 一端为黏性末端一端为平末端的连接方法
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zb0806030

银虫 (小有名气)

[求助] 一端为黏性末端一端为平末端的连接方法 已有3人参与

现在在做克隆，一端为PstI，一端为SmaI（平端），克隆后连接了全式金的T3载体，现在双酶切片段和载体后连接不上，哪位提供点好的建议，谢谢！
我用的T4连接酶是NEB的，体系10微升，4度连接过夜转化后也不长。
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厚积薄发
1楼 2014-07-10 19:07:04
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求生小曼

铁虫 (初入文坛)
★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-11 16:52:49
本帖内容被屏蔽
2楼2014-07-11 12:23:37
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zb0806030

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 求生小曼 at 2014-07-11 12:23:37
LZ你好，你的问题我也遇到过，首先建议你要保证你的酶（快切酶和连接酶）都是有活性的，其次就是按pEASY-T3载体的说明书来就行了，说实话，你说用T3载体，我真的没发现你说的SmaI位点在哪？
  你不能直接连上吗（T ...

我已经连接到T载体上了，现在是从T载体上用PstI/SmaI酶切连接目的载体连不上，谢谢
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厚积薄发
3楼2014-07-14 09:51:15
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fghjkyt

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2014-07-15 08:41:26
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=7221202&fpage=1
参见上面这个帖子
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4楼2014-07-14 10:23:08
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chenyhok1987

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
zb0806030(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-07-14 18:20:30
本人两个重组质粒都是一端平端一端粘度重组成功的，不过其中一共花费了两个月的时间，有些小长，总体来说这种连接方法还是蛮有难度的，一端连接效率快一端连接慢，连接反应效率处于不平衡的状态，难度大于双平端连接大于双黏端，有时候还需要一些运气的，其中载体和目的基因双酶切我是采用NEB的HF版本，试剂盒采用天根回收试剂盒，最好一步使用纯水洗脱，不推荐使用TE缓冲液，水是最好的溶剂，然后回收后目的基因和载体浓度都要加大一些浓度，你可以试试变换几个浓度连接，然后我使用大连宝生物的Solution1连接酶连接的，也是16度过夜的，最好前后做了两个重组质粒接近两个月吧出来的，时间比双黏端要久一些，楼主要有耐心，按照我的方法相信你一定可以做出来的！祝您好运~~~另外你的这个T4连接酶不适于这个连接，T4现在还是更适应于双黏端的连接！
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平生多磨砺，男儿自横行！
5楼2014-07-14 13:44:01
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moshangchenx

金虫 (正式写手)
楼主，您好！不知道您最终是怎么解决这个问题的，我现在做的这个一端平一端粘都快两个月了，还是连不上,请您赐教！
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科研无止境，我心成蹉跎
6楼2015-01-12 16:43:32
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