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一端为黏性末端一端为平末端的连接方法已有3人参与
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现在在做克隆，一端为PstI，一端为SmaI（平端），克隆后连接了全式金的T3载体，现在双酶切片段和载体后连接不上，哪位提供点好的建议，谢谢！ 我用的T4连接酶是NEB的，体系10微升，4度连接过夜转化后也不长。 |
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3楼2014-07-14 09:51:15
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感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2014-07-11 16:52:49
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2楼2014-07-11 12:23:37
4楼2014-07-14 10:23:08
chenyhok1987
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【答案】应助回帖
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zb0806030(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-07-14 18:20:30
zb0806030(西门吹雪170代发): 金币+4, 鼓励回帖交流 2014-07-14 18:20:30
| 本人两个重组质粒都是一端平端一端粘度重组成功的，不过其中一共花费了两个月的时间，有些小长，总体来说这种连接方法还是蛮有难度的，一端连接效率快一端连接慢，连接反应效率处于不平衡的状态，难度大于双平端连接大于双黏端，有时候还需要一些运气的，其中载体和目的基因双酶切我是采用NEB的HF版本，试剂盒采用天根回收试剂盒，最好一步使用纯水洗脱，不推荐使用TE缓冲液，水是最好的溶剂，然后回收后目的基因和载体浓度都要加大一些浓度，你可以试试变换几个浓度连接，然后我使用大连宝生物的Solution1连接酶连接的，也是16度过夜的，最好前后做了两个重组质粒接近两个月吧出来的，时间比双黏端要久一些，楼主要有耐心，按照我的方法相信你一定可以做出来的！祝您好运~~~另外你的这个T4连接酶不适于这个连接，T4现在还是更适应于双黏端的连接！ |
5楼2014-07-14 13:44:01