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寒心季

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于T4和solution I 的连接问题 已有3人参与

酶切液用T4的连接效果不是很好,后来有人告知可以用T载体中的solution I 连接。
原体系是这样的: 酶切液                10ul
                             R-Adaptor            2ul
                            10XLigase buffer    2 ul
                            T4 DNA Ligase       2ul
                            水                          4ul
                    总共是20ul。
现在换成solution I 连接,请问体系该怎么样变?就 酶切液、R-Adaptor  、水、solution I 四样构成一个新体系,还需要其他吗?
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lijianfu12

银虫 (正式写手)

就按照说明书

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
好好搞学术
2楼2014-09-18 00:20:29
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huyan0817

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-09-18 18:29:49
酶切后要胶回收,不能直接用酶切液体做连接!T连接很容易,你上面的体系的有问题,一般连接前最好计算下载体与片断的摩尔比,一般1:3-1:10之间都非常好连接!solution I 里面包括Ligase buffer  和 T4 DNA Ligase ,用量是2倍的!10UL体系就用5UL的 solution I !个人认为楼主不是酶的问题,主要还是楼主体系没有计算和酶切产物没有胶回收!
3楼2014-09-18 08:37:19
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凤丫头1988

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
弱弱问一句,  R-Adaptor 是什么啊
最小的事情也要尽力
4楼2014-09-18 08:44:18
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寒心季

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by huyan0817 at 2014-09-18 08:37:19
酶切后要胶回收,不能直接用酶切液体做连接!T连接很容易,你上面的体系的有问题,一般连接前最好计算下载体与片断的摩尔比,一般1:3-1:10之间都非常好连接!solution I 里面包括Ligase buffer  和 T4 DNA Ligase ...

感谢回复!我是按照实验室的博士论文指导来做的。它这里的酶切液酶切的是双链cDNA,酶切后并未要求胶回收,体系也是按照指导来的,应该不会有太大问题。
5楼2014-09-18 10:14:29
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-09-18 18:30:00
DNA混合物与Solution I按照1:1混合就行。
6楼2014-09-18 17:41:40
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