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ufoloveshe

铜虫 (小有名气)

[求助] 镍柱纯化蛋白,遇到史上最顽固的杂蛋白 已有6人参与

做了很久的镍离子亲和层析纯化蛋白,遇到了史上最顽固的杂蛋白,怎么除都除不掉。而且浓缩后观察,貌似还有增多的趋势,实在令人费解。咪唑浓度设计梯度,增加到50mM时候就有目的蛋白析出,因此洗杂缓冲液一直设定在25mM,但杂蛋白貌似和镍柱结合的很紧密,洗杂缓冲液洗不下来,最后都和目的蛋白一同下来了。请大神指教。

镍柱纯化蛋白,遇到史上最顽固的杂蛋白
CYD浓缩后:M,原,浓缩管水洗液,缓,缓洗,25,25水洗,100,100水洗,胍2 (1).jpg


镍柱纯化蛋白,遇到史上最顽固的杂蛋白-1
TPK浓缩后:M,胍前,缓,25,100,胍2,M,CYD25,CYD-EDTA,CYD溜总 (1).jpg
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抱怨是你应有的惩罚
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zhenxiangkai

金虫 (正式写手)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-09-18 18:27:26
你可以尝试一下把填料的体积弄小点,或者里面加点甘油,TRIX-100 等减少非特异性聚集的东东,当然,你的还是不错的,后续还要过离子柱吗?分子筛?
6楼2014-09-17 15:21:21
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dongmings

木虫之王 (文学泰斗)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-09-18 18:27:33
杂蛋白可能是与柱子非特异性结合,也可能是与你的目的蛋白结合的。如果是与柱子结合的,用分子筛能除掉一部分,如果是与蛋白结合的,估计分子筛就不起作用了,你可以试试离子交换柱。
7楼2014-09-17 15:55:15
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忘记将来

木虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by ufoloveshe at 2014-09-18 17:09:22
木有,还在探索中

在破碎buffer里加10-20mM咪唑试试
14楼2014-09-19 08:59:38
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忘记将来

木虫 (正式写手)

引用回帖:
10楼: Originally posted by lpzl at 2014-09-18 18:04:12
我纯化后SDS-PAGE也有杂蛋白,还没解决呢。。。继续摸索中。...

镍柱 达不到完全纯化的目的的 肯定会有一些杂蛋白,要求高的话 除非你几个纯化方法连用
15楼2014-09-19 09:00:54
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ufoloveshe

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
11楼: Originally posted by kuenyunliu at 2014-09-18 21:44:58
一个镍柱能解决所有蛋白的问题那其他产品还用来干嘛
如果一定要拿到非常纯的蛋白样品的话,尝试多个柱子联用吧

老板非说需要蛋白浓度达到百分之九十以上才让过分子筛,比较郁闷啊
抱怨是你应有的惩罚
16楼2014-09-19 09:04:31
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普通回帖

lpzl

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
楼主解决了么??
Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
2楼2014-09-17 09:14:20
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sxr1268

新虫 (初入文坛)

同问。。
3楼2014-09-17 11:00:22
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忘记将来

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
那你用40mM或者45mM洗呀,
4楼2014-09-17 13:03:06
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树在田野

金虫 (小有名气)

50洗啊

[ 发自小木虫客户端 ]
好好学习
5楼2014-09-17 13:35:56
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ufoloveshe

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 忘记将来 at 2014-09-17 13:03:06
那你用40mM或者45mM洗呀,

试了,目的蛋白也会跟着出来,貌似杂蛋白结合的太紧,也好像是目的蛋白结合的太松
抱怨是你应有的惩罚
8楼2014-09-18 14:00:15
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ufoloveshe

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lpzl at 2014-09-17 09:14:20
楼主解决了么??

木有,还在探索中
抱怨是你应有的惩罚
9楼2014-09-18 17:09:22
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lpzl

木虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
9楼: Originally posted by ufoloveshe at 2014-09-18 17:09:22
木有,还在探索中

我纯化后SDS-PAGE也有杂蛋白,还没解决呢。。。继续摸索中。
Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
10楼2014-09-18 18:04:12
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