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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

[求助] 蛋白浓度过高加热成团 已有1人参与

用RIPA裂解液提取的蛋白浓度过高,跑胶上样前加热变性就结成一团果冻状的东西了,该怎么解决?
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

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引用回帖:
3楼: Originally posted by weizhi111 at 2014-09-06 19:56:16
你说的有道理,但我同一批样,浓度高的是19ug/ul左右,浓度稍低的是7-8ug/ul左右,就只有这个19ug/ul的出现这种现象,其他的正常。如果要sonicate,是在哪步做呢?是提取完蛋白之后超声,然后再加热变性还是?...

这浓度的确够高的!为什么要者么高的浓度?对我来说,3-4mg/ml已经足够高了,通常是1-2mg/ml。当然了,我常常用24孔板收集细胞做Western,所以不可能有很高的蛋白浓度。我一般是常规做一下sonication的。

什么时候做都可以。相信sonicate后会解决你的问题。
4楼2014-09-07 09:02:39
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-09-07 20:53:28
引用回帖:
5楼: Originally posted by weizhi111 at 2014-09-06 21:23:51
谢谢,不知超声多久,用多大功率合适,不会把蛋白打断吧...

1、时间不用太久,十几秒就可以了,如果再长,可以分几次超声,如每次10s,三次等。
2、功率取决于机器,用不着太大功率。
3、超声对蛋白无影响,除非大功率下长时间超声引起发热,造成蛋白变性。

超声时注意:如果你的体积太小,要特别注意用小功率,否则会产生大量气泡,使超声无效。最小体积要看你的探头的大小。就我而言,50微升以上都没问题。当然就操作而言,体积越大约容易。
6楼2014-09-07 10:38:02
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ssssllllnnnn

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
weizhi111(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-06 22:55:22
weizhi111: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-09-07 08:56:28
你侧过蛋白浓度吗?
这不是蛋白浓度过高的结果,是genomic DNA。只要sonicate以下就可以了。
2楼2014-09-06 12:26:57
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-09-06 12:26:57
你侧过蛋白浓度吗?
这不是蛋白浓度过高的结果,是genomic DNA。只要sonicate以下就可以了。

你说的有道理,但我同一批样,浓度高的是19ug/ul左右,浓度稍低的是7-8ug/ul左右,就只有这个19ug/ul的出现这种现象,其他的正常。如果要sonicate,是在哪步做呢?是提取完蛋白之后超声,然后再加热变性还是?
3楼2014-09-07 08:56:16
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

引用回帖:
4楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-09-07 09:02:39
这浓度的确够高的!为什么要者么高的浓度?对我来说,3-4mg/ml已经足够高了,通常是1-2mg/ml。当然了,我常常用24孔板收集细胞做Western,所以不可能有很高的蛋白浓度。我一般是常规做一下sonication的。

什么时 ...

谢谢,不知超声多久,用多大功率合适,不会把蛋白打断吧
5楼2014-09-07 10:23:51
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-09-07 10:38:02
1、时间不用太久,十几秒就可以了,如果再长,可以分几次超声,如每次10s,三次等。
2、功率取决于机器,用不着太大功率。
3、超声对蛋白无影响,除非大功率下长时间超声引起发热,造成蛋白变性。

超声时注意 ...

谢谢,我试试,希望有效
7楼2014-09-07 10:51:15
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爱你的小虫

新虫 (初入文坛)

超声不会出现冻状物?我超声以后还有冻状物,离心DNA会沉淀?是不是要离心久点?
8楼2014-09-09 17:40:22
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 爱你的小虫 at 2014-09-09 17:40:22
超声不会出现冻状物?我超声以后还有冻状物,离心DNA会沉淀?是不是要离心久点?

我超声了还是有冻状物,离心时间也挺长的(快20min-30min)了,有的还是不行,浓度低的相对要好一些。所以浓度还是别太高了。
9楼2014-09-10 19:28:25
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爱你的小虫

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by weizhi111 at 2014-09-10 19:28:25
我超声了还是有冻状物,离心时间也挺长的(快20min-30min)了,有的还是不行,浓度低的相对要好一些。所以浓度还是别太高了。...

浓度低些没影响跑胶?多大浓度?

[ 发自小木虫客户端 ]
10楼2014-09-11 01:00:26
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