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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » 蛋白浓度过高加热成团
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

[求助] 蛋白浓度过高加热成团 已有1人参与

用RIPA裂解液提取的蛋白浓度过高，跑胶上样前加热变性就结成一团果冻状的东西了，该怎么解决？
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1楼 2014-09-06 10:23:02
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

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引用回帖:
3楼: Originally posted by weizhi111 at 2014-09-06 19:56:16
你说的有道理，但我同一批样，浓度高的是19ug/ul左右，浓度稍低的是7-8ug/ul左右，就只有这个19ug/ul的出现这种现象，其他的正常。如果要sonicate，是在哪步做呢？是提取完蛋白之后超声，然后再加热变性还是？...

这浓度的确够高的！为什么要者么高的浓度？对我来说，3-4mg/ml已经足够高了，通常是1-2mg/ml。当然了，我常常用24孔板收集细胞做Western，所以不可能有很高的蛋白浓度。我一般是常规做一下sonication的。

什么时候做都可以。相信sonicate后会解决你的问题。
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4楼2014-09-07 09:02:39
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 应助指数+1, 鼓励回帖交流 2014-09-07 20:53:28
引用回帖:
5楼: Originally posted by weizhi111 at 2014-09-06 21:23:51
谢谢，不知超声多久，用多大功率合适，不会把蛋白打断吧...

1、时间不用太久，十几秒就可以了，如果再长，可以分几次超声，如每次10s，三次等。
2、功率取决于机器，用不着太大功率。
3、超声对蛋白无影响，除非大功率下长时间超声引起发热，造成蛋白变性。

超声时注意：如果你的体积太小，要特别注意用小功率，否则会产生大量气泡，使超声无效。最小体积要看你的探头的大小。就我而言，50微升以上都没问题。当然就操作而言，体积越大约容易。
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6楼2014-09-07 10:38:02
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ssssllllnnnn

至尊木虫 (知名作家)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
weizhi111(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-09-06 22:55:22
weizhi111: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-09-07 08:56:28
你侧过蛋白浓度吗？
这不是蛋白浓度过高的结果，是genomic DNA。只要sonicate以下就可以了。
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2楼2014-09-06 12:26:57
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-09-06 12:26:57
你侧过蛋白浓度吗？
这不是蛋白浓度过高的结果，是genomic DNA。只要sonicate以下就可以了。

你说的有道理，但我同一批样，浓度高的是19ug/ul左右，浓度稍低的是7-8ug/ul左右，就只有这个19ug/ul的出现这种现象，其他的正常。如果要sonicate，是在哪步做呢？是提取完蛋白之后超声，然后再加热变性还是？
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3楼2014-09-07 08:56:16
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-09-07 09:02:39
这浓度的确够高的！为什么要者么高的浓度？对我来说，3-4mg/ml已经足够高了，通常是1-2mg/ml。当然了，我常常用24孔板收集细胞做Western，所以不可能有很高的蛋白浓度。我一般是常规做一下sonication的。

什么时 ...

谢谢，不知超声多久，用多大功率合适，不会把蛋白打断吧
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5楼2014-09-07 10:23:51
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ssssllllnnnn at 2014-09-07 10:38:02
1、时间不用太久，十几秒就可以了，如果再长，可以分几次超声，如每次10s，三次等。
2、功率取决于机器，用不着太大功率。
3、超声对蛋白无影响，除非大功率下长时间超声引起发热，造成蛋白变性。

超声时注意 ...

谢谢，我试试，希望有效
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7楼2014-09-07 10:51:15
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爱你的小虫

新虫 (初入文坛)
超声不会出现冻状物？我超声以后还有冻状物，离心DNA会沉淀？是不是要离心久点？
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8楼2014-09-09 17:40:22
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 爱你的小虫 at 2014-09-09 17:40:22
超声不会出现冻状物？我超声以后还有冻状物，离心DNA会沉淀？是不是要离心久点？

我超声了还是有冻状物，离心时间也挺长的（快20min-30min)了，有的还是不行，浓度低的相对要好一些。所以浓度还是别太高了。
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9楼2014-09-10 19:28:25
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爱你的小虫

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by weizhi111 at 2014-09-10 19:28:25
我超声了还是有冻状物，离心时间也挺长的（快20min-30min)了，有的还是不行，浓度低的相对要好一些。所以浓度还是别太高了。...

浓度低些没影响跑胶?多大浓度?

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10楼2014-09-11 01:00:26
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