24小时热门版块排行榜    

查看: 2466  |  回复: 20

紫夜微蓝

新虫 (初入文坛)

[求助] 最近蛋白诱导表达遇到了瓶颈 已有5人参与

本人新手,第一次做蛋白的诱导表达,不知为何始终表达不出。。用的载体是pET32a,BL21(BE3)宿主菌,IPTG 0.1-1mM梯度诱导,试过了37度4h、20度、25度过夜,但始终未见明显条带。。现在无从下手了

恳请论坛的各位高手们给予宝贵的意见,小女子感激不尽
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
30度12小时尝试过没有?
2楼2014-09-04 16:24:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

紫夜微蓝

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-09-04 16:24:59
30度12小时尝试过没有?

没有,但28度8小时尝试过诶,是不是时间太短呢
3楼2014-09-04 16:28:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

留小保

铁虫 (小有名气)

之前测序什么的全没有问题吗?
人生若只如初见 何事秋风悲画扇
4楼2014-09-04 17:37:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

紫夜微蓝

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 留小保 at 2014-09-04 17:37:09
之前测序什么的全没有问题吗?

只测了目的片段的正确性,没有问题。自己查了下稀有密码子数,不知道怎么才算多
5楼2014-09-04 19:49:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wmx551551

新虫 (小有名气)

换载体啊亲
6楼2014-09-05 16:02:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xipha

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
1, 如果要IPTG梯度诱导的话,要小心培养基里面的成分. 有时候培养基里面的糖就足够诱导了.
2, 你的融合蛋白有细胞毒性么? 如果有的话,摇不起来是很常见的,需要加大抗生素浓度,延长诱导前摇菌时间, 降低培养基里面的乳糖类似物的含量,减少诱导时间. 2小时以上的诱导就不用试了.
3, 包涵体蛋白, 如果你的表达蛋白容易形成包涵体,需要透析复性.
暂时就能想到这么多,不行的话就像楼上说的,楼主换表达体系吧. 祝顺利
7楼2014-09-06 02:48:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

紫夜微蓝

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by xipha at 2014-09-06 02:48:47
1, 如果要IPTG梯度诱导的话,要小心培养基里面的成分. 有时候培养基里面的糖就足够诱导了.
2, 你的融合蛋白有细胞毒性么? 如果有的话,摇不起来是很常见的,需要加大抗生素浓度,延长诱导前摇菌时间, 降低培养基里面的 ...

谢谢,我现在诱导前后有差异了,但是大小比我预测的要小很多(预测37kd,实际约17kd上下)。不明白是怎么回事啊
8楼2014-09-07 09:44:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xipha

木虫 (正式写手)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 紫夜微蓝 at 2014-09-07 09:44:35
谢谢,我现在诱导前后有差异了,但是大小比我预测的要小很多(预测37kd,实际约17kd上下)。不明白是怎么回事啊...

这个就不懂了, 照理说单阅读框是不会有几个亚基的. 会不会不是你的蛋白?
9楼2014-09-09 08:23:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

可能是蛋白有毒性,或者蛋白分子量大。小蛋白表达量高。
10楼2014-09-09 12:29:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 紫夜微蓝 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 344求调剂 +3 knight344 2026-03-16 3/150 2026-03-16 09:42 by 无际的草原
[考研] 0703化学调剂 290分有科研经历,论文在投 +6 腻腻gk 2026-03-14 6/300 2026-03-16 09:39 by 闲人终南山
[考研] 材料专硕306英一数二 +3 z1z2z3879 2026-03-16 3/150 2026-03-16 09:19 by Demonsssss
[考研] 中科院材料273求调剂 +3 yzydy 2026-03-15 3/150 2026-03-15 21:15 by ms629
[考研] 265求调剂 +4 威化饼07 2026-03-12 4/200 2026-03-14 17:23 by userper
[考研] 一志愿安徽大学材料工程专硕313分,求调剂的学校 +8 Yu先生 2026-03-10 10/500 2026-03-14 01:04 by JourneyLucky
[考研] 0856材料与化工309分求调剂 +6 ZyZy…… 2026-03-10 6/300 2026-03-14 00:38 by JourneyLucky
[考研] 271求调剂 +10 生如夏花… 2026-03-11 10/500 2026-03-14 00:35 by 卖报员小雨
[考研] 招收0805(材料)调剂 +3 18595523086 2026-03-13 3/150 2026-03-14 00:33 by 123%、
[考研] 复试调剂 +9 Copy267 2026-03-10 9/450 2026-03-13 23:45 by userper
[考研] 290求调剂 +9 ADT 2026-03-11 9/450 2026-03-13 21:55 by JourneyLucky
[考研] 304求调剂 +7 7712b 2026-03-13 7/350 2026-03-13 21:42 by peike
[考研] 329求调剂 +3 miaodesi 2026-03-12 4/200 2026-03-13 20:53 by 18595523086
[考研] 求调剂 +7 18880831720 2026-03-11 7/350 2026-03-13 16:10 by JourneyLucky
[考研] 【0856】化学工程(085602)313 分,本科学科评估A类院校化学工程与工艺,诚求调剂 +7 小刘快快上岸 2026-03-11 7/350 2026-03-13 16:06 by ruiyingmiao
[论文投稿] 投稿问题 5+4 星光灿烂xt 2026-03-12 6/300 2026-03-13 14:17 by god_tian
[考研] 26考研求调剂 +5 丶宏Sir 2026-03-13 5/250 2026-03-13 13:05 by JourneyLucky
[考研] 293求调剂,一志愿陕师大生物学 +3 ??????.?.??? 2026-03-09 3/150 2026-03-11 10:02 by 学员8dgXkO
[基金申请] 提交后的基金本子,已让学校撤回了,可否换口子提交 +3 dut_pfx 2026-03-10 3/150 2026-03-11 08:38 by kudofaye
[考博] 26申博求助 +3 跳跃饼干 2026-03-10 4/200 2026-03-10 21:15 by Tntcnn
信息提示
请填处理意见