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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 最近蛋白诱导表达遇到了瓶颈
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紫夜微蓝

新虫 (初入文坛)

[求助] 最近蛋白诱导表达遇到了瓶颈 已有5人参与

本人新手，第一次做蛋白的诱导表达，不知为何始终表达不出。。用的载体是pET32a，BL21（BE3）宿主菌，IPTG 0.1-1mM梯度诱导，试过了37度4h、20度、25度过夜，但始终未见明显条带。。现在无从下手了

恳请论坛的各位高手们给予宝贵的意见，小女子感激不尽
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1楼 2014-09-04 15:04:39
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
30度12小时尝试过没有？
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2楼2014-09-04 16:24:59
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紫夜微蓝

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wolfman840 at 2014-09-04 16:24:59
30度12小时尝试过没有？

没有，但28度8小时尝试过诶，是不是时间太短呢
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3楼2014-09-04 16:28:05
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留小保

铁虫 (小有名气)
之前测序什么的全没有问题吗？
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人生若只如初见 何事秋风悲画扇
4楼2014-09-04 17:37:09
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紫夜微蓝

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 留小保 at 2014-09-04 17:37:09
之前测序什么的全没有问题吗？

只测了目的片段的正确性，没有问题。自己查了下稀有密码子数，不知道怎么才算多
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5楼2014-09-04 19:49:44
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wmx551551

新虫 (小有名气)
换载体啊亲
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6楼2014-09-05 16:02:10
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xipha

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1, 如果要IPTG梯度诱导的话,要小心培养基里面的成分. 有时候培养基里面的糖就足够诱导了.
2, 你的融合蛋白有细胞毒性么? 如果有的话,摇不起来是很常见的,需要加大抗生素浓度,延长诱导前摇菌时间, 降低培养基里面的乳糖类似物的含量,减少诱导时间. 2小时以上的诱导就不用试了.
3, 包涵体蛋白, 如果你的表达蛋白容易形成包涵体,需要透析复性.
暂时就能想到这么多,不行的话就像楼上说的,楼主换表达体系吧. 祝顺利
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7楼2014-09-06 02:48:47
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紫夜微蓝

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xipha at 2014-09-06 02:48:47
1, 如果要IPTG梯度诱导的话,要小心培养基里面的成分. 有时候培养基里面的糖就足够诱导了.
2, 你的融合蛋白有细胞毒性么? 如果有的话,摇不起来是很常见的,需要加大抗生素浓度,延长诱导前摇菌时间, 降低培养基里面的 ...

谢谢，我现在诱导前后有差异了，但是大小比我预测的要小很多（预测37kd，实际约17kd上下）。不明白是怎么回事啊
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8楼2014-09-07 09:44:35
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xipha

木虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 紫夜微蓝 at 2014-09-07 09:44:35
谢谢，我现在诱导前后有差异了，但是大小比我预测的要小很多（预测37kd，实际约17kd上下）。不明白是怎么回事啊...

这个就不懂了, 照理说单阅读框是不会有几个亚基的. 会不会不是你的蛋白?
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9楼2014-09-09 08:23:18
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

可能是蛋白有毒性，或者蛋白分子量大。小蛋白表达量高。
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10楼2014-09-09 12:29:38
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