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张冰宝

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白诱导表达的蛋白片段比目的蛋白小了一倍,怎么回事? 已有4人参与

最近在做诱导蛋白表达,预期蛋白大小78kd左右,尝试了一些温度,IPTG浓度也设了梯度,时间也有延长,在oD值在0.6-0.8时开始诱导,结果都没有诱导出来,室温诱导过夜后,在34kd处条带粗,但是与所要蛋白小了大概一半,不知是怎么回事?恳请大家帮忙分析一下原因,急啊
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for5

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-05-24 12:50:01
34k的带你鉴定了是你蛋白吗?或者是什么大的融合标签么?

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
操蛋的XX
2楼2014-05-24 10:22:39
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HYZ221314

至尊木虫 (职业作家)

优秀版主

赞同二楼,各路神马可能都有,

[ 发自小木虫客户端 ]
青山不断,绿水长流
3楼2014-05-24 10:35:36
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张冰宝

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by for5 at 2014-05-24 10:22:39
34k的带你鉴定了是你蛋白吗?或者是什么大的融合标签么?

这个我要如何鉴定呢?我现在还不确定,但是它确实比对照粗
4楼2014-05-24 12:12:17
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for5

木虫 (正式写手)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-27 18:58:02
引用回帖:
4楼: Originally posted by 张冰宝 at 2014-05-24 12:12:17
这个我要如何鉴定呢?我现在还不确定,但是它确实比对照粗...

做个wb。很多人这时候会认为表达不完全,或者降解什么的,但是其实真实的原因都需要你仔细验证排查才能知道

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
操蛋的XX
5楼2014-05-24 13:02:09
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anyaxiong

铁杆木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-24 20:39:29
楼主的蛋白比较大,降解的可能性是有的,根据蛋白所带的标签鉴定下,至于降解,可以尝试将诱导时间缩短,诱导开始时的OD值增大到1试试,祝好运
爱拼才会赢
6楼2014-05-24 18:29:39
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wsym

新虫 (初入文坛)

我这边也遇到了相同的情况,50kd的表达在25kd左右。WB带在25kd,基因上游标签抗体。
7楼2014-05-26 10:15:01
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张冰宝

新虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by wsym at 2014-05-26 10:15:01
我这边也遇到了相同的情况,50kd的表达在25kd左右。WB带在25kd,基因上游标签抗体。

那后来怎么解决的呢
8楼2014-05-26 14:21:40
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张冰宝

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by anyaxiong at 2014-05-24 18:29:39
楼主的蛋白比较大,降解的可能性是有的,根据蛋白所带的标签鉴定下,至于降解,可以尝试将诱导时间缩短,诱导开始时的OD值增大到1试试,祝好运

我连接的是pet-32a载体,用的内切酶是xho1(上游) 和Ecor1(下游).但是载体上的蛋白表达顺序是 Ecor1,xho1,。想问一下 我这样是不是弄反了,这样反方向表达与我的蛋白不出有关系吗?
9楼2014-05-26 14:27:14
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aloha

金虫 (小有名气)

反向了,你还认为是自己的蛋白!!? 我都吐血了
信仰科学,文献无界
10楼2014-05-26 14:59:08
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