应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建基因文库的方法筛选到阳性克隆，克隆中插入的基因长为8000bp，如何找到目的基因？
51/1返回列表
查看: 2843  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

小科研女dow

木虫 (小有名气)

[求助] 构建基因文库的方法筛选到阳性克隆，克隆中插入的基因长为8000bp，如何找到目的基因？ 已有3人参与

各位虫子们，大家好，小虫今天提出一个长久困扰的问题，希望得到大家的建议，先谢过了~
最近做基因文库，采用的PUC19作为载体，将不完全酶切的片段插入该载体中后，转化大肠杆菌DH5α，经过筛选得到阳性克隆，将阳性克隆单菌落培养提取质粒后送去测序公司测序，得到一个片段为8000bp的结果，以下为后续工作中遇到的问题：
1、目的基因应该不至于是8000bp这么大，小虫认为实际的目的片段式这8000bp中的一部分，经过软件划分ORF做了几个阅读框的表达，但是均无活性。
2、PUC19不是表达型质粒，所以没有办法将筛选的重组质粒直接转化到Rosetta和BL-21中大量表达，得不到目的蛋白。
3、曾经见过有人对PUC19做过改造，可以用于表达蛋白，而不是仅仅用来克隆，但是自己经验欠缺，没有这方面的基础。
4、还有人说，可以采用可以启动表达的宿主菌，也只是听说，并未接触过。

楼主主要的目的是在这8000bp中寻觅到真正的目的片段，请问有什么好的意见吗？先谢过了!
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

functional genomics

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
做出色的科研人
1楼 2014-08-28 17:05:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小科研女dow(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-29 20:47:19
8000bp？你是测通了吗？
“将不完全酶切的片段插入该载体中后”为什么是不完全酶切而不是完全酶切
还有质粒你跑电泳了吗 与与其的大小是否符合
赞一下 回复此楼
3楼2014-08-29 10:44:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答

小科研女dow

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by happydove at 2014-08-29 10:44:54
8000bp？你是测通了吗？
“将不完全酶切的片段插入该载体中后”为什么是不完全酶切而不是完全酶切
还有质粒你跑电泳了吗 与与其的大小是否符合

不完全酶切这个微生物的基因组，然后建文库。
8000bp是阳性克隆，送给公司公司给测通了
质粒大小正确。
请问有什么办法可以从这8000中缩短片段吗？
赞一下 回复此楼
做出色的科研人
4楼2014-08-29 13:19:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小科研女dow: 金币+15, ★★★很有帮助 2014-08-30 09:41:00
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-31 19:08:35
一步步做亚克隆，一点点缩短，不要一下就掂出来orf做表达，可能需要几个基因才有活性

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
6楼2014-08-30 09:09:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小科研女dow

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-30 09:09:05
一步步做亚克隆，一点点缩短，不要一下就掂出来orf做表达，可能需要几个基因才有活性

现在的打算是这样的，但是一步步的亚克隆该选择什么样的方法呢？之前确实想过可能是几个基因一起在起作用，但是8000的片段，比如采用2分法来做，层主觉得可以吗？有更明智的办法么？
赞一下 回复此楼
做出色的科研人
7楼2014-08-30 09:42:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 人气不行了 +11 fansofjerry 2026-08-21 11/550 2026-08-25 11:04 by 孤独的英雄6
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +19 羊腰板 2026-08-21 22/1100 2026-08-25 10:38 by popular289
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +5 process2012 2026-08-23 7/350 2026-08-25 09:42 by huixian257
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +17 kkkl_v 2026-08-19 18/900 2026-08-25 09:41 by windflowerwy
[基金申请] 我面上完蛋了 +13 且听虎啸 2026-08-20 14/700 2026-08-25 09:10 by mrkang
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +7 炎黄贵胄 2026-08-22 8/400 2026-08-25 08:48 by ZJTJZ
[基金申请] 明天应该可查了！？ +5 chengyan1220 2026-08-23 5/250 2026-08-24 23:28 by 我4大白菜
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +7 scalable 2026-08-24 7/350 2026-08-24 23:01 by anata1209
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +21 koalala 2026-08-24 24/1200 2026-08-24 19:25 by 家与远方
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +14 ziyangfang 2026-08-19 17/850 2026-08-24 18:37 by 哈哈蛤？
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +13 kulium 2026-08-21 16/800 2026-08-24 16:27 by superceng
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +17 医学老男孩 2026-08-20 21/1050 2026-08-24 14:21 by refreshing11
[基金申请] 朋友圈看到的 +7 wangzilk 2026-08-18 9/450 2026-08-24 10:50 by cmrandy
[基金申请] 放榜前的不淡定 20+4 snowwithsea 2026-08-19 17/850 2026-08-24 10:20 by echo8914667
[基金申请] 科研孤儿太难了 +18 我4大白菜 2026-08-20 19/950 2026-08-24 09:47 by 凯恩广盛催化分�
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭