应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 构建基因文库的方法筛选到阳性克隆，克隆中插入的基因长为8000bp，如何找到目的基因？
181/2返回列表12下一页
查看: 2866  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

小科研女dow

木虫 (小有名气)

[求助] 构建基因文库的方法筛选到阳性克隆，克隆中插入的基因长为8000bp，如何找到目的基因？ 已有3人参与

各位虫子们，大家好，小虫今天提出一个长久困扰的问题，希望得到大家的建议，先谢过了~
最近做基因文库，采用的PUC19作为载体，将不完全酶切的片段插入该载体中后，转化大肠杆菌DH5α，经过筛选得到阳性克隆，将阳性克隆单菌落培养提取质粒后送去测序公司测序，得到一个片段为8000bp的结果，以下为后续工作中遇到的问题：
1、目的基因应该不至于是8000bp这么大，小虫认为实际的目的片段式这8000bp中的一部分，经过软件划分ORF做了几个阅读框的表达，但是均无活性。
2、PUC19不是表达型质粒，所以没有办法将筛选的重组质粒直接转化到Rosetta和BL-21中大量表达，得不到目的蛋白。
3、曾经见过有人对PUC19做过改造，可以用于表达蛋白，而不是仅仅用来克隆，但是自己经验欠缺，没有这方面的基础。
4、还有人说，可以采用可以启动表达的宿主菌，也只是听说，并未接触过。

楼主主要的目的是在这8000bp中寻觅到真正的目的片段，请问有什么好的意见吗？先谢过了!
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

functional genomics

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
做出色的科研人
1楼 2014-08-28 17:05:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小科研女dow

木虫 (小有名气)
2楼2014-08-29 10:06:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

happydove

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小科研女dow(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-08-29 20:47:19
8000bp？你是测通了吗？
“将不完全酶切的片段插入该载体中后”为什么是不完全酶切而不是完全酶切
还有质粒你跑电泳了吗 与与其的大小是否符合
赞一下 回复此楼
3楼2014-08-29 10:44:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小科研女dow

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by happydove at 2014-08-29 10:44:54
8000bp？你是测通了吗？
“将不完全酶切的片段插入该载体中后”为什么是不完全酶切而不是完全酶切
还有质粒你跑电泳了吗 与与其的大小是否符合

不完全酶切这个微生物的基因组，然后建文库。
8000bp是阳性克隆，送给公司公司给测通了
质粒大小正确。
请问有什么办法可以从这8000中缩短片段吗？
赞一下 回复此楼
做出色的科研人
4楼2014-08-29 13:19:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小科研女dow

木虫 (小有名气)
5楼2014-08-30 09:00:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小科研女dow: 金币+15, ★★★很有帮助 2014-08-30 09:41:00
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-08-31 19:08:35
一步步做亚克隆，一点点缩短，不要一下就掂出来orf做表达，可能需要几个基因才有活性

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
6楼2014-08-30 09:09:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小科研女dow

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-30 09:09:05
一步步做亚克隆，一点点缩短，不要一下就掂出来orf做表达，可能需要几个基因才有活性

现在的打算是这样的，但是一步步的亚克隆该选择什么样的方法呢？之前确实想过可能是几个基因一起在起作用，但是8000的片段，比如采用2分法来做，层主觉得可以吗？有更明智的办法么？
赞一下 回复此楼
做出色的科研人
7楼2014-08-30 09:42:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小科研女dow: 金币+20, ★★★很有帮助 2014-08-30 18:37:24
引用回帖:
7楼: Originally posted by 小科研女dow at 2014-08-30 09:42:55
现在的打算是这样的，但是一步步的亚克隆该选择什么样的方法呢？之前确实想过可能是几个基因一起在起作用，但是8000的片段，比如采用2分法来做，层主觉得可以吗？有更明智的办法么？...

就是二分法，一步步来，有些蛋白是要3-4个在一起才能发挥作用，他们要形成四级结构的蛋白复合体

[ 发自小木虫客户端 ]
赞一下 回复此楼
8楼2014-08-30 15:56:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小科研女dow

木虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by bio_sci at 2014-08-30 15:56:51
就是二分法，一步步来，有些蛋白是要3-4个在一起才能发挥作用，他们要形成四级结构的蛋白复合体
...

非常感谢，那就这么做了~~
赞一下 回复此楼
做出色的科研人
9楼2014-08-30 18:36:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小科研女dow

木虫 (小有名气)
10楼2014-08-31 17:47:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 小科研女dow 的主题更新
181/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 能否申诉？ +4 echo8914667 2026-08-30 5/250 2026-08-30 21:11 by echo8914667
[基金申请] 面上意见出来了 +9 黄鸟于飞Chao 2026-08-29 18/900 2026-08-30 16:47 by 黄鸟于飞Chao
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[基金申请] 29号明天会评吗 +3 笨笨唐 2026-08-28 3/150 2026-08-30 09:29 by cww8181
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 11/550 2026-08-30 07:57 by gouxfjh
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +4 349506619 2026-08-28 4/200 2026-08-29 22:41 by alongwaytogo
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +15 晴天加油 2026-08-26 16/800 2026-08-29 18:28 by symmetry
[基金申请] 基金不中，共勉 +11 eulota 2026-08-26 11/550 2026-08-28 14:22 by 火星超人xi
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +5 zhaosm1982 2026-08-27 6/300 2026-08-27 16:00 by lfy8008
[文学芳草园] 梦想 +3 myrtle 2026-08-26 3/150 2026-08-27 10:01 by angelyueyi
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +8 scalable 2026-08-24 8/400 2026-08-25 12:52 by jnhyjjm
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭